مستقیم PCR واکنشی است که مستقیماً از بافت های حیوانی یا گیاهی برای تکثیر بدون استخراج اسید نوکلئیک استفاده می کند.از بسیاری جهات، PCR مستقیم مانند PCR معمولی عمل می کند

تفاوت اصلی در بافر سفارشی مورد استفاده در PCR مستقیم است، نمونه را می توان مستقیماً تحت واکنش PCR بدون استخراج اسید نوکلئیک قرار داد، اما الزامات مربوطه برای تحمل آنزیم ها و سازگاری بافر درگیر در واکنش مستقیم PCR وجود دارد.

اگرچه کم و بیش مهارکننده‌های PCR در نمونه‌های رایج وجود دارد، PCR مستقیم همچنان می‌تواند تحت تأثیر آنزیم‌ها و بافرها به تقویت قابل اعتمادی دست یابد.واکنش سنتی PCR به اسید نوکلئیک با کیفیت بالا به عنوان یک الگو نیاز دارد، که اگر الگو حاوی پروتئین و سایر ناخالصی‌ها باشد، می‌تواند از پیشرفت یکنواخت واکنش PCR جلوگیری کند.Direct PCR در حال حاضر یکی از محبوب ترین فناوری ها در زمینه تشخیص مولکولی است.

01 Direct PCR در ابتدا برای حیوانات و گیاهان استفاده می شد

اولین کاربرد PCR مستقیم در زمینه حیوانات و گیاهان است، مانند خون، بافت و موی موش صحرایی، گربه، مرغ، خرگوش، گوسفند، گاو و غیره، برگ ها و دانه های گیاه و غیره، که برای مطالعه ژنوتیپ، تراریخته، تشخیص پلاسمید، تجزیه و تحلیل حذف ژن، تجزیه و تحلیل منبع DNA و شناسایی منبع دیگر، گونه ها، گونه ها استفاده می شود.

این میدان ها دارای برخی ویژگی های مشترک هستند، یعنی محتوای ژن هدف نسبتاً زیاد است و استخراج اسید نوکلئیک دردسرساز است، بنابراین PCR مستقیم نه تنها می تواند در زمان صرفه جویی کند و تأثیر کمی بر نتایج داشته باشد، بلکه در هزینه نیز صرفه جویی کند.

استفاده از PCR مستقیم برای تشخیص پاتوژن موضوعی است که در سال های اخیر مورد استفاده قرار می گیرد، برخی از تولیدکنندگان معرف PCR در هنگام ایجاد نوآوری تلاش های زیادی در این راستا انجام داده اند.به‌ویژه در این همه‌گیری COVID-19، بسیاری از محصولات تشخیصی از این دست در بازار ظاهر شده‌اند، مانند کیت تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (روش پروب فلورسنت PCR Multiplex) که توسط Foregene تحقیق و توسعه شده است، که از فناوری Real-time RT PCR (rRT-PCR) برای تشخیص کیفی SARS-CoV-Nucleic Acid یا SARS-CoV-Nucleic Acid استفاده می‌کند. نمونه های سواب ال.

Foregene یکی از شرکت هایی است که از فناوری Direct PCR برای تشخیص ORF1ab، N، E، و طبیعی استفاده می کند.گونه اسیدهای نوکلئیک را در نمونه‌های سواب نازوفارنکس یا اوروفارنکس انسان مانند SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK)، B.1.351 lineage (ZA)، B.1.617 lineage (IND) و P.1 lineage (BR) قرار می‌دهد.

02  معرف های مورد نیاز برای PCR مستقیم

نمونه Lysate

نمونه لیزات را می توان توسط خودتان پیکربندی یا خریداری کرد.تفاوت در ترکیب مارک های مختلف لیز باعث می شود که توانایی لیزینگ متفاوت باشد و سپس زمان لیزینگ کمی متفاوت خواهد بود.به عنوان مثال، برای تهیه نمونه های بافت حیوانی، لیز 30 دقیقه یا یک شبه به طور کلی توصیه می شود و محلول لیز برای ویروس ها بین 3-10 دقیقه است.

ترکیب اصلی PCR

توصیه می شود از DNA پلیمراز شروع داغ برای تقویت تقویت خاص و افزایش توانایی تقویت استفاده شود.هسته PCR مستقیم یک پلیمراز بسیار متحمل است.

حذف یا مهار اجزای موجود در نمونه که بر تقویت DNA تأثیر می گذارد

پس از پردازش نمونه با لیز، پروتئین ها، لیپیدها و سایر بقایای سلولی آزاد می شوند، این مواد واکنش PCR را مهار می کنند.بنابراین، PCR مستقیم نیاز به افزودن حذف یا مهارکننده های مربوطه برای کاهش تأثیر این عوامل دارد.

03  مجموعه ای از پنج نقطه دانش PCR مستقیم

اولاً، فناوری Direct PCR یک فناوری PCR مستقیم برای نمونه‌های بیولوژیکی مختلف است.در این شرایط فنی، نیازی به جداسازی و استخراج اسید نوکلئیک، استفاده مستقیم از نمونه بافت به عنوان شیء و افزودن پرایمرهای ژن هدف برای انجام واکنش PCR نیست.

دوم، فناوری مستقیم PCR نه تنها یک فناوری سنتی تقویت الگوی DNA است، بلکه شامل PCR رونویسی معکوس الگوی RNA نیز می شود.

سوم، فناوری مستقیم PCR نه تنها مستقیماً واکنش‌های معمول کیفی PCR را روی نمونه‌های بافتی انجام می‌دهد، بلکه شامل واکنش‌های qPCR Real-Time نیز می‌شود، که به سیستم واکنش نیاز دارد تا قابلیت تداخل فلورسانس ضد پس‌زمینه قوی داشته باشد و فلورسانس درون‌زا توانایی آنتاگونیستی را خاموش می‌کند.

چهارم، نمونه هایی که با فناوری Direct PCR مورد هدف قرار می گیرند، فقط به آزادسازی قالب های اسید نوکلئیک نیاز دارند و پروتئین ها، پلی ساکاریدها، یون های نمک و غیره را که در واکنش PCR تداخل دارند حذف نمی کنند.که به پلیمراز اسید نوکلئیک و مخلوط PCR در سیستم واکنش نیاز دارد تا مقاومت و سازگاری عالی داشته باشد تا از فعالیت آنزیم و دقت همانندسازی در شرایط پیچیده اطمینان حاصل شود.

پنجم، نمونه بافتی که با فناوری Direct PCR بدون هیچ گونه عملیات غنی‌سازی اسید نوکلئیک مورد هدف قرار می‌گیرد و مقدار قالب بسیار کم است، که لازم است سیستم واکنش دارای حساسیت و راندمان تقویت فوق‌العاده بالایی باشد.