فناوری تشخیص مولکولی از روش‌های زیست‌شناسی مولکولی برای تشخیص بیان و ساختار ماده ژنتیکی بدن انسان و عوامل بیماری‌زا مختلف استفاده می‌کند تا به هدف پیش‌بینی و تشخیص بیماری‌ها دست یابد.

در سال های اخیر، با ارتقاء و تکرار فناوری تشخیص مولکولی، کاربرد بالینی تشخیص مولکولی بیش از پیش گسترده و عمیق شده است و بازار تشخیص مولکولی وارد دوره توسعه سریع شده است.

نویسنده فناوری‌های رایج تشخیص مولکولی موجود در بازار را خلاصه می‌کند و به سه بخش تقسیم می‌شود: بخش اول فناوری PCR، بخش دوم فناوری تقویت همدما اسید نوکلئیک و بخش دوم فناوری توالی‌یابی را معرفی می‌کند.

01

بخش اول: فناوری PCR

تکنولوژی PCR

PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یکی از فناوری های تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی است که سابقه ای بیش از 30 سال دارد.

فناوری PCR در سال 1983 توسط Kary Mullis از Cetus، ایالات متحده آمریکا پیشگام شد.Mullis در سال 1985 برای ثبت اختراع PCR درخواست داد و اولین مقاله دانشگاهی PCR در مورد Science را در همان سال منتشر کرد.مولیس در سال 1993 برنده جایزه نوبل شیمی شد.

اصول اولیه PCR

PCR می تواند قطعات DNA هدف را بیش از یک میلیون بار تقویت کند.اصل این است که تحت کاتالیز DNA پلیمراز، DNA رشته اصلی به عنوان یک الگو استفاده می شود و یک آغازگر خاص به عنوان نقطه شروع برای گسترش استفاده می شود.در شرایط آزمایشگاهی از طریق مراحلی مانند دناتوراسیون، بازپخت و گسترش تکرار می شود.فرآیند DNA رشته دختر مکمل DNA الگوی رشته مادر.

فرآیند استاندارد PCR به سه مرحله تقسیم می شود:

1. دناتوراسیون: از دمای بالا برای جداسازی رشته های دوتایی DNA استفاده کنید.پیوندهای هیدروژنی بین رشته های دوتایی DNA در دمای بالا (93-98 درجه سانتیگراد) شکسته می شود.

2. بازپخت: پس از جدا شدن DNA دو رشته ای، دما را پایین می آورند تا پرایمر بتواند به DNA تک رشته ای متصل شود.

3. گسترش: DNA پلیمراز شروع به سنتز رشته های مکمل در امتداد رشته های DNA از آغازگرهای متصل با کاهش دما می کند.هنگامی که گسترش کامل شد، یک چرخه کامل می شود و تعداد قطعات DNA دو برابر می شود.

با برگشت این سه مرحله 25-35 بار، تعداد قطعات DNA به طور تصاعدی افزایش می یابد.

خلاقیت PCR این است که می توان پرایمرهای مختلفی را برای ژن های هدف مختلف طراحی کرد، به طوری که قطعات ژن هدف را می توان در مدت زمان کوتاهی تکثیر کرد.

تاکنون PCR را می توان به سه دسته PCR معمولی، PCR کمی فلورسنت و PCR دیجیتال تقسیم کرد.

نسل اول PCR معمولی

از یک ابزار معمولی تقویت PCR برای تکثیر ژن مورد نظر استفاده کنید و سپس از الکتروفورز ژل آگارز برای تشخیص محصول استفاده کنید، فقط می توان آنالیز کیفی را انجام داد.

معایب اصلی PCR نسل اول:

- مستعد تقویت غیر اختصاصی و نتایج مثبت کاذب.

-تشخیص زمان زیادی می برد و عملیات دست و پا گیر است.

-فقط تست کیفی قابل انجام است.

نسل دوم فلورسانس کمی PCR

PCR کمی فلورسانس (Real-Time PCR)، همچنین به عنوان qPCR شناخته می شود، برای نظارت بر تجمع محصولات تقویت شده از طریق تجمع سیگنال های فلورسنت با افزودن پروب های فلورسنت که می توانند پیشرفت سیستم واکنش را نشان دهند و برای قضاوت نتایج از طریق منحنی فلورسانس استفاده می شود و می توان با کمک منحنی مقدار C را کمیت کرد.

از آنجایی که فناوری qPCR در یک سیستم بسته انجام می‌شود، احتمال آلودگی کاهش می‌یابد و سیگنال فلورسانس می‌تواند برای تشخیص کمی نظارت شود، بنابراین بیشترین استفاده در عمل بالینی است و به فناوری غالب در PCR تبدیل شده است.

مواد فلورسنت مورد استفاده در PCR کمی فلورسنت زمان واقعی را می توان به موارد زیر تقسیم کرد: پروب های فلورسنت TaqMan، چراغ های مولکولی و رنگ های فلورسنت.

1) پروب فلورسنت TaqMan:

در طی تقویت PCR، یک پروب فلورسنت خاص در حالی که یک جفت پرایمر اضافه می شود، اضافه می شود.پروب یک الیگونوکلئوتید است و دو انتهای آن به ترتیب با یک گروه فلورسنت گزارشگر و یک گروه فلورسنت خاموش کننده برچسب گذاری شده اند.

هنگامی که پروب دست نخورده است، سیگنال فلورسنت ساطع شده توسط گروه گزارشگر توسط گروه خاموش کننده جذب می شود.در طی تقویت PCR، فعالیت اگزونوکلئاز 5'-3' آنزیم Taq، پروب را می شکافد و تجزیه می کند، و گروه فلورسنت گزارشگر را خاموش می کند. سیگنال فلورسانس به طور کامل با تشکیل محصول PCR هماهنگ است.

2) رنگهای فلورسنت SYBR:

در سیستم واکنش PCR، مقدار اضافی رنگ فلورسنت SYBR اضافه می شود.پس از اینکه رنگ فلورسنت SYBR به طور غیر اختصاصی در DNA دو رشته ای گنجانده شد، یک سیگنال فلورسنت منتشر می کند.مولکول رنگ SYBR که در زنجیره گنجانده نشده است هیچ سیگنال فلورسنتی منتشر نمی کند، در نتیجه سیگنال فلورسنت افزایش محصولات PCR کاملاً با افزایش محصولات PCR هماهنگ است.SYBR فقط به DNA دو رشته ای متصل می شود، بنابراین منحنی ذوب را می توان برای تعیین اینکه آیا واکنش PCR خاص است استفاده کرد.

3) چراغ های مولکولی

این یک کاوشگر الیگونوکلئوتیدی دارای دو نشاندار با حلقه ساقه است که ساختار سنجاق موی حدوداً 8 پایه را در انتهای 5 و 3 تشکیل می دهد.توالی‌های اسید نوکلئیک در هر دو انتها به طور مکمل جفت می‌شوند و باعث می‌شوند که گروه فلورسنت و گروه کوئنچ محکم شوند.ببندید، فلورسانس تولید نمی کند.

پس از تولید محصول PCR، در طی فرآیند بازپخت، قسمت میانی فانوس مولکولی با یک توالی DNA خاص جفت می‌شود و ژن فلورسنت از ژن quencher جدا می‌شود تا فلورسانس تولید کند.

معایب اصلی PCR نسل دوم:

حساسیت هنوز وجود ندارد و تشخیص نمونه های کم کپی دقیق نیست.

تأثیر ارزش پس‌زمینه وجود دارد، و نتیجه مستعد تداخل است.

نسل سوم دیجیتال PCR

PCR دیجیتال (DigitalPCR، dPCR، Dig-PCR) تعداد کپی توالی هدف را از طریق تشخیص نقطه پایانی محاسبه می کند و می تواند بدون استفاده از کنترل های داخلی و منحنی های استاندارد، تشخیص کمی مطلق را انجام دهد.

دیجیتال PCR از تشخیص نقطه پایانی استفاده می‌کند و به مقدار Ct (آستانه چرخه) بستگی ندارد، بنابراین واکنش دیجیتال PCR کمتر تحت تأثیر راندمان تقویت قرار می‌گیرد و تحمل به مهارکننده‌های واکنش PCR با دقت و تکرارپذیری بالا بهبود می‌یابد.

با توجه به ویژگی های حساسیت بالا و دقت بالا، به راحتی توسط مهار کننده های واکنش PCR تداخل پیدا نمی کند و می تواند به کمیت مطلق واقعی بدون محصولات استاندارد که تبدیل به یک کانون تحقیقاتی و کاربردی شده است، دست یابد.

با توجه به اشکال مختلف واحد واکنش، می توان آن را به سه نوع تقسیم کرد: سیستم های میکروسیال، تراشه و قطره.