چندین اختراع انقلابی در تاریخچه فناوری تشخیص در ذهن من، فناوری برچسب‌گذاری ایمنی بر اساس اصل اتصال اختصاصی آنتی‌ژن-آنتی‌بادی، فناوری PCR و فناوری توالی‌یابی است.امروز در مورد فناوری PCR صحبت خواهیم کرد.با توجه به تکامل فناوری PCR، مردم معمولاً فناوری PCR را به سه نسل تقسیم می‌کنند: فناوری PCR معمولی، فناوری PCR کمی فلورسنت و فناوری PCR دیجیتال.
Cتکنیک معمولی PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
کری مولیس واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، PCR) را در سال 1983 اختراع کرد. گفته می‌شود زمانی که او در حال رانندگی دوست دخترش بود، ناگهان الهام گرفت و به اصل PCR (در مورد فواید رانندگی) فکر کرد.کری مولیس در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد. نیویورک تایمز اظهار داشت: "بسیار اصیل و مهم، تقریباً زیست شناسی را به دوره های قبل از PCR و پس از PCR تقسیم می کند.
اصل PCR: تحت کاتالیز DNA پلیمراز، DNA رشته مادر به عنوان الگو استفاده می شود و پرایمر اختصاصی به عنوان نقطه شروع گسترش استفاده می شود و DNA رشته دختر مکمل DNA الگوی رشته مادر در شرایط آزمایشگاهی از طریق دناتوراسیون، بازپخت، گسترش و مراحل دیگر کپی می شود.این یک فناوری تقویت سنتز DNA در شرایط آزمایشگاهی است که می تواند به سرعت و به طور خاص هر DNA هدف را در شرایط آزمایشگاهی تکثیر کند.
مزایای PCR معمولی
1.روش کلاسیک، استانداردهای کامل بین المللی و داخلی
2.هزینه کمتر معرف های ابزار
3.محصولات PCR را می توان برای سایر آزمایشات زیست شناسی مولکولی بازیابی کرد
دستگاه PCR پیشنهادی Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
محصولات مرتبط: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
معایب PCR معمولی
1.آسان برای آلوده کردن
2.عملیات دست و پا گیر
3.فقط تحلیل کیفی
4.حساسیت متوسط
5.تقویت غیر اختصاصی وجود دارد و زمانی که باند غیر اختصاصی به اندازه باند هدف باشد، نمی توان آن را تشخیص داد.
CPCR مبتنی بر الکتروفورز آپیلاری
در پاسخ به کاستی های PCR معمولی، برخی از تولیدکنندگان ابزارهایی را بر اساس اصل الکتروفورز مویرگی معرفی کرده اند.مرحله الکتروفورز پس از تقویت PCR در مویرگی کامل می شود.حساسیت بیشتر است و تفاوت چند پایه قابل تشخیص است و تقویت توسط MAERKER قابل محاسبه است.محتوای محصولنقطه ضعف این است که محصول PCR هنوز باید باز شود و در ابزار قرار داده شود و همچنان خطر آلودگی زیادی وجود دارد.
CآپیلاریEلکتروفورز
2. فناوری PCR کمی فلورسنت (Quantitative Real-time PCR, qPCR) در زمان واقعیفلورسنت کمی PCR، همچنین به نام Real-Time PCR، یک فناوری کمی اسید نوکلئیک جدید است که توسط PE (پرکین المر) در سال 1995 توسعه یافته است.اگر علاقه مند هستید، می توانید آن را بررسی کنید.این تکنیک در حال حاضر بالغ ترین و پرکاربردترین روش نیمه کمی PCR است.
دستگاه qPCR توصیه شده:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
روش رنگ فلورسنت (SYBR Green I):SYBR Green I متداول‌ترین رنگ مورد استفاده برای اتصال به DNA برای PCR کمی است که به طور غیر اختصاصی به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شود.در حالت آزاد، SYBR Green فلورسانس ضعیفی منتشر می کند، اما هنگامی که به DNA دو رشته ای متصل می شود، فلورسانس آن 1000 برابر افزایش می یابد.بنابراین، کل سیگنال فلورسنت ساطع شده توسط یک واکنش متناسب با مقدار DNA دو رشته ای موجود است و با افزایش محصول تقویت شده افزایش خواهد یافت.از آنجایی که رنگ به طور غیر اختصاصی به DNA دو رشته ای متصل می شود، ممکن است نتایج مثبت کاذب ایجاد شود.
محصولات مرتبط: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
روش پروب فلورسنت (فناوری Taqman): در طولبا تقویت PCR، یک پروب فلورسنت خاص همزمان با یک جفت پرایمر اضافه می شود.کاوشگر یک اولیگونوکلئوتید خطی است که به ترتیب در هر دو انتها یک گروه گزارشگر فلورسنت و یک گروه خاموش کننده فلورسنت نشاندار شده است.هنگامی که کاوشگر دست نخورده است، سیگنال فلورسنت ساطع شده توسط گروه گزارشگر توسط گروه خاموش کننده جذب می شود و تشخیص هیچ سیگنال فلورسنتی وجود ندارد.در طی تقویت PCR (در مرحله گسترش)، فعالیت دایسر 5'-3' آنزیم Taq کاوشگر را هضم و تجزیه می کند، به طوری که گروه فلورسنت گزارشگر و گروه فلورسنت خاموش کننده از هم جدا می شوند، به طوری که سیستم نظارت فلورسانس می تواند سیگنال فلورسنت دریافت کند، یعنی هر بار که یک مولسان فلورسنت کامل می شود، دریافت می شود. همگام سازی تجمع سیگنال های فلورسنت و تشکیل محصولات PCR.روش کاوشگر Taqman متداول ترین روش تشخیصی در تشخیص بالینی است.
محصولات مرتبط: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
مزایای qPCR
1.روش بالغ است و تجهیزات پشتیبانی و معرف ها کامل است
2.قیمت متوسط معرف ها
3.آسان برای استفاده
4.حساسیت و ویژگی تشخیص بالا
معایب qPCR
جهش ژن هدف منجر به تشخیص نادرست می شود.
نتیجه تشخیص الگوی کم غلظت قابل تعیین نیست.
هنگام استفاده از منحنی استاندارد برای تشخیص کمی خطای بزرگی وجود دارد.
3. فناوری PCR دیجیتال (دیجیتال PCR، dPCR).
دیجیتال PCR تکنیکی برای تعیین کمیت مطلق مولکول های اسید نوکلئیک است.در مقایسه با qPCR، PCR دیجیتال می‌تواند مستقیماً تعداد مولکول‌های DNA/RNA را بخواند، که کمیت مطلق مولکول‌های اسید نوکلئیک در نمونه اولیه است.در سال 1999، Bert Vogelstein و Kenneth W. Kin-Zler به طور رسمی مفهوم dPCR را پیشنهاد کردند.
در سال 2006، Fluidigm برای اولین بار ابزار تجاری dPCR مبتنی بر تراشه را تولید کرد.در سال 2009، Life Technologies سیستم‌های OpenArray و QuantStudio 12K Flex dPCR را راه‌اندازی کرد.در سال 2013، Life Technologies سیستم QuantStudio 3DdPCR را راه‌اندازی کرد که از فناوری تراشه‌های میکروسیال در مقیاس نانو با چگالی بالا برای توزیع یکنواخت نمونه‌ها در 20000 سلول منفرد استفاده می‌کند.در واکنش به خوبی
در سال 2011، Bio-Rad ابزار قطره‌ای QX100 dPCR را راه‌اندازی کرد که از فناوری آب در روغن برای توزیع یکنواخت نمونه به 20000 قطره آب در روغن استفاده می‌کند و از یک تحلیلگر قطره برای تجزیه و تحلیل قطرات استفاده می‌کند.در سال 2012، RainDance ابزار RainDrop dPCR را راه‌اندازی کرد که توسط گاز پرفشار هدایت می‌شد تا هر سیستم واکنش استاندارد را به یک امولسیون واکنشی حاوی 1 میلیون تا 10 میلیون میکرو قطرات در سطح پیکولیتر تقسیم کند.
تا کنون، دیجیتال PCR دو جناح اصلی، نوع چیپ و نوع قطره ای تشکیل داده است.مهم نیست چه نوع PCR دیجیتالی، اصول اصلی آن محدود کردن رقت، PCR نقطه پایانی و توزیع پواسون است.سیستم استاندارد واکنش PCR حاوی قالب های اسید نوکلئیک به طور مساوی به ده ها هزار واکنش PCR تقسیم می شود که به تراشه ها یا ریز قطرات توزیع می شوند، به طوری که هر واکنش تا حد امکان حاوی یک مولکول الگو است و یک واکنش PCR الگوی تک مولکولی انجام می شود.با خواندن فلورسانس وجود یا عدم وجود سیگنال شمارش می شود و کمیت مطلق پس از کالیبراسیون توزیع آماری پواسون انجام می شود.
موارد زیر ویژگی های چندین پلت فرم دیجیتال PCR است که من استفاده کرده ام:
1. Bio-Rad QX200 قطره ای PCR دیجیتال Bio-RadQX200 یک پلت فرم دیجیتال بسیار کلاسیک PCR است، فرآیند تشخیص اولیه: 20000 نمونه توسط مولد قطرات تولید می شود.عملیات پیچیده تر است و خطر آلودگی متوسط است.
PCR دیجیتال میکرو قطره ای Xinyi TD1Xinyi TD1 یک پلت فرم دیجیتال داخلی PCR است، فرآیند تشخیص اولیه: تولید 30000-50000 قطره آب در روغن از طریق یک مولد قطره، تقویت بر روی یک ابزار PCR مشترک و در نهایت عبور قطره خوان سیگنال فلورسنت هر قطره را می خواند.هم تولید قطرات و هم خواندن در این پلت فرم در یک تراشه اختصاصی با خطر آلودگی کم انجام می شود.
STILLA Naica تراشه میکرو قطره دیجیتال PCRSTILLA Naica یک پلت فرم دیجیتال PCR نسبتا جدید است.فرآیند تشخیص اولیه این است: محلول واکنش را به تراشه اضافه کنید، تراشه را در سیستم تولید و تقویت میکرو قطره قرار دهید و 30000 میکرو قطره تولید کنید.روی تراشه پخش می شود و تقویت PCR روی تراشه کامل می شود.سپس تراشه تقویت شده به سیستم تجزیه و تحلیل خواندن میکرو قطره منتقل می شود و سیگنال فلورسنت با گرفتن عکس خوانده می شود.از آنجایی که کل فرآیند در یک تراشه بسته انجام می شود، خطر آلودگی کم است.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D تراشه PCR دیجیتال
ThermoFisher QuantStudio 3D یکی دیگر از پلتفرم های کلاسیک PCR دیجیتال مبتنی بر تراشه است.فرآیند تشخیص اولیه آن به این صورت است: محلول واکنش را به پخش کننده اضافه کنید و محلول واکنش را به طور یکنواخت روی تراشه با 20000 میکرو چاه از طریق پخش کننده پخش کنید.تراشه را روی دستگاه PCR قرار دهید تا تقویت شود و در نهایت تراشه را داخل ریدر قرار دهید و برای خواندن سیگنال فلورسنت عکس بگیرید.عملیات نسبتاً پیچیده است و کل فرآیند در یک تراشه بسته انجام می شود و خطر آلودگی کم است.
5. JN MEDSYS Clarity chip دیجیتال PCR
JN MEDSYS Clarity یک پلت فرم دیجیتال PCR نسبتاً جدید از نوع تراشه است.فرآیند تشخیص اولیه آن این است: محلول واکنش را به اپلیکاتور اضافه کنید و محلول واکنش را به طور مساوی روی 10000 لوله PCR ثابت شده در لوله PCR از طریق اپلیکاتور پخش کنید.بر روی تراشه ریز متخلخل، محلول واکنش از طریق عمل مویرگی وارد تراشه می شود و لوله PCR به همراه تراشه برای تقویت روی دستگاه PCR قرار می گیرد و در نهایت تراشه در ریدر قرار می گیرد تا با گرفتن عکس، سیگنال فلورسنت را بخواند.عملیات پیچیده تر است.خطر آلودگی کم است.
پارامترهای هر پلت فرم دیجیتال PCR به شرح زیر خلاصه می شود:
شاخص های ارزیابی پلت فرم دیجیتال PCR عبارتند از: تعداد واحدهای تقسیم شده، تعداد کانال های فلورسنت، پیچیدگی عملکرد و خطر آلودگی.اما مهمترین چیز دقت تشخیص است.یکی از راه‌های ارزیابی پلت‌فرم‌های دیجیتال PCR، استفاده از چندین پلتفرم دیجیتال PCR برای تایید یکدیگر است و راه دیگر استفاده از مواد استاندارد با مقادیر دقیق است.
مزایای dPCR
1.دستیابی به کمیت مطلق
2.حساسیت و ویژگی بالاتر
3.می تواند نمونه های کم کپی را تشخیص دهد
معایب dPCR1. تجهیزات و معرف های گران قیمت 2. عملیات پیچیده و زمان تشخیص طولانی 3. محدوده تشخیص باریک
در حال حاضر سه نسل از فناوری PCR دارای مزایا و معایب خاص خود هستند و هر کدام زمینه های کاربردی خاص خود را دارند و این رابطه ای نیست که یک نسل جایگزین نسل دیگر شود.پیشرفت مداوم فناوری، حیات جدیدی را به فناوری PCR تزریق کرده است، و آن را قادر می‌سازد یک جهت برنامه را پس از دیگری باز کند و تشخیص اسید نوکلئیک را راحت‌تر و دقیق‌تر کند.
منبع: دکتر یوان شما را برای آزمایش می برد
محصولات پیشنهادی:
زمان ارسال: نوامبر-18-2022
