COVID-19 یک بیماری عفونی ناشی از سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس نوع 2 است. هنگامی که فردی آلوده می شود، شایع ترین علائم شامل تب، سرفه و تنگی نفس است.

نمونه های مورد استفاده برای آزمایش را می توان با سواب نازوفارنکس یا سواب اوروفارنکس جمع آوری کرد.

PCR چیست؟

روش استاندارد تشخیص کروناویروس واکنش زنجیره ای پلیمراز، PCR است.این روشی است که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی استفاده می شود.می تواند به سرعت میلیون ها تا میلیاردها قطعه خاص DNA را کپی کند.

کروناویروس جدید حاوی یک ژنوم RNA تک رشته ای بسیار طولانی است.برای شناسایی این ویروس‌ها با PCR، مولکول‌های RNA باید توسط ترانس کریپتاز معکوس به توالی‌های DNA مکمل خود تبدیل شوند و سپس DNA جدید سنتز شده را می‌توان با روش‌های استاندارد PCR که معمولاً به عنوان RT-PCR شناخته می‌شود، تقویت کرد.

فرآیند RT-PCR

استخراج RNA

برای انجام این روش اساساً باید RNA ویروسی استخراج شود.برای جداسازی راحت، سریع و موثر می توان از انواع کیت های تصفیه RNA استفاده کرد.

برای استخراج RNA ویروسی با استفاده از کیت تجاری، ابتدا نمونه را به یک لوله میکروسانتریفیوژ اضافه کنید و سپس آن را با بافر لیز مخلوط کنید.این بافر به شدت دناتوره شده است و معمولاً از فنل و گوانیدین ایزوتیوسیانات تشکیل شده است.علاوه بر این، مهارکننده‌های RNase معمولاً در بافر لیز برای اطمینان از جداسازی RNA ویروسی دست‌نخورده وجود دارند.

پس از افزودن بافر لیز، لوله اختلاط را با پالس ورتکس کرده و در دمای اتاق انکوبه کنید.سپس ویروس تحت شرایط بسیار دناتوره کننده که توسط بافر لیز ارائه می شود، لیز می شود.

پس از لیز شدن نمونه، از یک لوله سانتریفیوژ برای فرآیند خالص سازی استفاده می شود.نمونه در لوله سانتریفیوژ بارگذاری شده و سپس سانتریفیوژ می شود.

این روش یک روش استخراج فاز جامد است که در آن فاز ساکن از یک ماتریس سیلیکاژل تشکیل شده است.

تحت شرایط بهینه نمک و pH، مولکول های RNA به غشای سیلیس متصل می شوند.

در همان زمان، پروتئین و سایر آلاینده ها حذف می شوند.

پس از سانتریفیوژ، لوله سانتریفیوژ را در یک لوله جمع آوری تمیز قرار دهید، فیلتر را دور بریزید و سپس بافر شستشو را اضافه کنید.

لوله را دوباره در سانتریفیوژ قرار دهید تا بافر شستشو را وارد غشاء کند.با این کار تمام ناخالصی های باقی مانده از غشاء حذف می شود و تنها RNA متصل به سیلیکاژل باقی می ماند.

پس از شستشوی نمونه، لوله را در یک لوله میکرو سانتریفیوژ تمیز قرار داده و بافر شستشو را اضافه کنید.

سپس سانتریفیوژ می شود تا بافر شستشو را از طریق غشاء وادار کند.بافر شستشو RNA ویروسی را از ستون اسپین حذف می کند و RNA خالص عاری از پروتئین ها، بازدارنده ها و سایر آلاینده ها را به دست می آورد.

گام 2

کنسانتره مخلوط

پس از استخراج RNA ویروسی، مرحله بعدی آماده سازی مخلوط واکنش برای تقویت PCR است.در این مرحله از کنسانتره استفاده می شود.این محلول غلیظ یک محلول غلیظ از قبل مخلوط شده است که از یک پیش مخلوط، رونوشت معکوس، نوکلئوتیدها، پرایمر جلو، پرایمر معکوس، پروب TaqMan و DNA پلیمراز تشکیل شده است.

در نهایت برای تکمیل این مخلوط واکنش، الگوی RNA اضافه می شود.لوله ها با گرداب پالس مخلوط می شوند و سپس مخلوط واکنش در صفحه PCR بارگذاری می شود.صفحه PCR معمولاً شامل 96 چاهک است و می تواند چندین نمونه را به طور همزمان تجزیه و تحلیل کند.

مرحله 3

تقویت PCR

در مرحله بعد، پلیت را در دستگاه PCR قرار دهید که در اصل یک چرخه حرارتی است.

RT-PCR بلادرنگ برای تشخیص کروناویروس جدید 2019 با تقویت توالی هدف در ژن RdrRP، ژن E و ژن N استفاده می‌شود.انتخاب ژن هدف به پرایمر و توالی پروب بستگی دارد.

اولین مرحله RT-PCR رونویسی معکوس است.اولین رشته DNA مکمل سنتز می شود که توسط پرایمر معکوس PCR آغاز می شود که به قسمت مکمل ژنوم RNA ویروسی متصل می شود.سپس رونوشت معکوس، نوکلئوتیدهای DNA را به انتهای 3 پرایمر اضافه می کند تا DNA مکمل RNA ویروس را سنتز کند.دما و مدت این مرحله به پرایمرها، RNA هدف و ترانس کریپتاز معکوس مورد استفاده بستگی دارد.

در مرحله بعد، یک مرحله دناتوراسیون اولیه اعمال می شود که منجر به دناتوره شدن هیبرید RNA-DNA می شود.این مرحله برای فعال کردن DNA پلیمراز ضروری است.در همان زمان، ترانس کریپتاز معکوس غیر فعال می شود.

PCR شامل یک سری چرخه حرارتی است.هر چرخه شامل مراحل دناتوراسیون، بازپخت و گسترش است.

مرحله دناتوراسیون شامل گرم کردن محفظه واکنش تا 95 درجه سانتیگراد و استفاده از آن برای دناتوره کردن الگوی DNA دو رشته ای است.

در مرحله بعد، دمای واکنش به 58 درجه سانتیگراد کاهش می یابد و به پرایمر جلویی اجازه می دهد تا به قسمت مکمل الگوی DNA تک رشته ای خود بازپخت.دمای بازپخت مستقیماً به طول و ترکیب پرایمر بستگی دارد.

در مرحله گسترش، DNA پلیمراز یک رشته DNA جدید را سنتز می کند که مکمل رشته الگوی DNA است.با افزودن هسته های آزاد مکمل به الگو در جهت 5 تا 3 از مخلوط واکنش.دمای این مرحله به DNA پلیمراز مورد استفاده بستگی دارد.

پس از چرخه اول، یک هدف DNA دو رشته ای به دست می آید.

سپس وارد چرخه دوم شوید.DNA دو رشته ای برای تولید دو مولکول DNA تک رشته ای دناتوره می شود.

در مرحله بعد، دمای واکنش کاهش می‌یابد، پرایمرها به هر الگوی DNA تک رشته‌ای آنیل می‌شوند و پروب Taq-man به قسمت مکمل DNA هدف بازپخت می‌شود.

کاوشگر TaqMan از یک فلوروفور تشکیل شده است که به طور کووالانسی به انتهای 5 پروب الیگونوکلئوتیدی متصل است.هنگامی که توسط منبع نور چرخنده تحریک می شود، فلوروفور فلورسانس ساطع می کند.علاوه بر این، کاوشگر از یک خاموش کننده در انتهای 3 تشکیل شده است.نزدیکی ژن گزارشگر به کوئنچر از تشخیص فلورسانس جلوگیری می کند.

در مرحله گسترش، DNA پلیمراز رشته جدیدی را سنتز می کند.هنگامی که پلیمراز به پروب TaqMan می رسد، فعالیت درون زا 5 نوکلئاز آن، پروب را می شکافد و رنگ را از خاموش کننده جدا می کند.

با هر چرخه PCR، مولکول‌های رنگ بیشتری آزاد می‌شوند و در نتیجه شدت فلورسانس متناسب با تعداد آمپلیکون‌های سنتز شده افزایش می‌یابد.

این روش امکان تخمین تعداد یک توالی معین موجود در نمونه را فراهم می کند.تعداد قطعات DNA دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود.بنابراین می توان از PCR برای آنالیز نمونه های بسیار کوچک استفاده کرد.

برای اندازه گیری سیگنال فلورسنت، لامپ هالوژن تنگستن، فیلتر تحریک، بازتابنده، لنز، فیلتر انتشار و شارژ دستگاه همراه با دوربین CCD استفاده کنید.

مرحله 4 شناسایی

برای اندازه گیری سیگنال فلورسنت، لامپ هالوژن تنگستن، فیلتر تحریک، بازتابنده، لنز، فیلتر انتشار و شارژ دستگاه همراه با دوربین CCD استفاده کنید.

نور فیلتر شده از لامپ توسط بازتابنده منعکس می شود، از لنز کندانسور عبور می کند و به مرکز هر سوراخ متمرکز می شود.سپس فلورسانس ساطع شده از سوراخ از آینه منعکس می شود، از فیلتر انتشار عبور می کند و توسط دوربین CCD شناسایی می شود.در هر چرخه PCR، نور فلوروفور خود تحریک شده توسط CCD قابل تشخیص است.

نور گرفته شده را به داده های دیجیتال تبدیل می کند.این روش Real-Time PCR نامیده می شود و امکان نظارت بلادرنگ از پیشرفت واکنش PCR را فراهم می کند.