راهنمای تجزیه و تحلیل مسئله

تجزیه و تحلیل زیر از مشکلاتی که ممکن است در آنها با آن مواجه شویدکل گیاهRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

ستون چرخش مسدود شده است

انسداد ستون اسپین باعث کاهش بازده RNA یا حتی ناتوانی در خالص سازی برای بدست آوردن RNA می شود و کیفیت RNA بدست آمده پایین خواهد بود.

تجزیه و تحلیل علت شایع:

1. نمونه به طور کامل شکسته نشده است.

تکه تکه شدن نمونه ناقص می تواند ستون پاک کننده DNA را مسدود کند، که می تواند بر عملکرد و کیفیت RNA نیز تأثیر بگذارد.توصیه می کنیم هنگام انجام تکه تکه شدن نمونه، به سرعت در مقادیر کافی نیتروژن مایع خرد کنید تا بافت هایی مانند دیواره های سلولی و غشای سلولی نمونه ها تا حد امکان شکسته شود.برای نمونه های گیاهی پلی ساکاریدهای پلی فنل، توصیه می کنیم از Plant Total RNA Isolation Kit Plus استفاده کنید.

2. مایع رویی جدا شده از ستون پاک کننده DNA را آسپیره کنید، گلوله بقایای سلولی احتمالی را آسپیره کنید.

گلوله بقایای سلولی آسپیره شده می تواند ستون فقط RNA را در طی مراحل جذب RNA مسدود کند (مرحله 5 روش، مرحله 6 روش پلی فنل پلی ساکارید را ببینید).توصیه می‌کنیم هنگام آسپیراسیون این مایع رویی مراقب باشید تا از آسپیره شدن بقایای سلولی جلوگیری شود.

3. مقدار اولیه نمونه خیلی زیاد است.

استفاده بیش از حد از نمونه منجر به تکه تکه شدن نمونه ناقص یا لیز ناقص سلول ها توسط بافر PRL1 یا بافر PSL1 می شود که منجر به مسدود شدن ستون تصفیه برای عملیات تصفیه می شود.کیت جداسازی RNA توتال گیاهی حداکثر 50 میلی گرم اولیه در هر خالص سازی یک نمونه عمل شده دارد.برای نمونه‌های گیاهی پلی‌ساکاریدهای پلی‌فنل، توصیه می‌کنیم کیت جداسازی RNA توتال گیاهی پلاس را امتحان کنید.

4. دمای سانتریفیوژ خیلی پایین است.

جداسازی و خالص سازی RNA کل به جز اختلال نیتروژن مایع در بافت نمونه، تمام مراحل در دمای اتاق (20-25 درجه سانتی گراد) انجام می شود.برخی از سانتریفیوژهای با دمای پایین دمای کمتر از 20 درجه سانتیگراد دارند که می تواند باعث انسداد در ستون پاک کننده DNA و/یا ستون فقط RNA شود.اگر این اتفاق افتاد، دمای سانتریفیوژ را روی 25-20 درجه سانتیگراد تنظیم کنید و مخلوط لیز و/یا افزودن مایع رویی جداسازی اتانول را از قبل گرم کنید تا 37 درجه سانتیگراد.

هیچ RNA استخراج نشده یا بازده RNA کم است

معمولاً عوامل زیادی بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارند، مانند: محتوای RNA نمونه، روش عملیات، حجم شستشو و غیره.

تجزیه و تحلیل علل شایع به شرح زیر:

1. حمام یخ یا سانتریفیوژ با دمای پایین (4 درجه سانتیگراد) در طول عملیات انجام شد.

پیشنهاد: در کل فرآیند در دمای اتاق (15-25 درجه سانتیگراد) کار کنید، از حمام یخ و سانتریفیوژ با دمای پایین خودداری کنید.

       2.RNA به دلیل نگهداری نادرست نمونه یا نگهداری طولانی مدت نمونه تخریب شده است.

توصیه: نمونه های تازه جمع آوری شده باید به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شوند و سپس در دمای 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری شوند، از انجماد و ذوب مکرر نمونه ها جلوگیری شود.یا بلافاصله نمونه ها را در محلول تثبیت کننده RNA RNAlater (نمونه های حیوانی) خیس کنید.

       3.تکه تکه شدن و لیز ناکافی نمونه منجر به انسداد ستون تصفیه می شود.

پیشنهاد: هنگام آسیاب کردن بافت، لطفاً مطمئن شوید که بافت به اندازه کافی آسیاب شده است و به سرعت آن را به بافر PSL1 از پیش آماده شده منتقل کنید (تأیید کنید که نسبت صحیح β-ME اضافه شده است، مرحله 1 روش را ببینید).

4. شوینده به اشتباه اضافه شده است.

پیشنهاد: مطمئن شوید که RNase-Free ddH₂O به وسط غشای ستون تصفیه چکه می شود.

5. حجم صحیح اتانول مطلق به بافر PSL2 یا بافر PRW2 اضافه نشده است.

پیشنهاد: لطفاً دستورالعمل ها را دنبال کنید، حجم صحیح اتانول مطلق را به بافر PSL2 و بافر PRW2 اضافه کنید و قبل از استفاده از کیت خوب مخلوط کنید.

6. مقدار نمونه بافت نامناسب است.

پیشنهاد: از 50 میلی گرم بافت در هر 500 میکرولیتر بافر PSL1 استفاده کنید.استفاده بیش از حد از بافت مقدار RNA استخراج شده را کاهش می دهد و خلوص RNA حاصل نیز کاهش می یابد.ما قویاً توصیه می کنیم که دوز اولیه نمونه نباید از 50 میلی گرم در هر عملیات استخراج RNA تجاوز کند.

7. حجم شستشو نامناسب یا شستشوی ناقص.

پیشنهاد: حجم شوینده ستون تصفیه 50-200 میکرولیتر است.اگر اثر شستشو رضایت بخش نباشد، توصیه می شود پس از افزودن ddH بدون RNase از قبل گرم شده، زمان را در دمای اتاق افزایش دهید.₂O، مانند 5-10 دقیقه.

8. ستون تصفیه پس از شستشو با بافر PRW2 دارای باقیمانده اتانول است.

   پیشنهاد: اگر لوله خالی به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ شود و پس از شستشو در بافر PRW2 هنوز اتانول باقی مانده است، می توانید زمان سانتریفیوژ لوله خالی را به 2 دقیقه افزایش دهید یا ستون تصفیه را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا اتانول باقیمانده به طور کامل حذف شود.

9. کیت اشتباه استفاده شده است.

   پیشنهاد: برای نمونه های گیاهی پلی ساکاریدهای پلی فنلی، استفاده از کیت های رایج مانند کیت جداسازی RNA توتال گیاهی ممکن است نتواند نمونه های RNA ایده آل را به دست آورد.ما به شما توصیه می کنیم از Plant Total RNA IsolationKit Plus استفاده کنید که به طور ویژه برای نمونه های گیاهی پلی ساکارید پلی فنولیک طراحی شده است.کیت ویژه ای برای استخراج RNA از نمونه های گیاهی پلی فنل و پلی ساکارید.

مقدار OD260/OD280 کم است

شستشوی RNA با ddH₂O و برای قرائت های اسپکتروفتومتر استفاده می شود در مقادیر OD260/OD280 کم است.توصیه می کنیم از 10 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5 (به جای ddH بدون RNase) استفاده کنید.₂O برای شستشوی RNA) برای به دست آوردن مقادیر نسبتاً صحیح OD260/OD280، به "آزمایش های غلظت و خالص سازی RNA" در صفحه 19 مراجعه کنید.

RNA خالص شده تجزیه می شود

کیفیت RNA خالص به عواملی مانند نگهداری نمونه، آلودگی RNase و دستکاری مرتبط است.

تجزیه و تحلیل علل شایع:

1. نمونه های بافت پس از جمع آوری به موقع نگهداری نشدند.

    توصیه: اگر نمونه‌های بافتی پس از جمع‌آوری به موقع استفاده نشد، لطفاً بلافاصله آن‌ها را در نیتروژن مایع در دمای پایین نگهداری کنید یا پس از انجماد سریع در نیتروژن مایع برای نگهداری طولانی‌مدت به -۸۰ درجه سانتی‌گراد انتقال دهید یا بلافاصله نمونه‌ها را در محلول تثبیت‌کننده RNA RNAlater (نمونه‌های حیوانی) غوطه‌ور کنید.برای استخراج RNA سعی کنید از نمونه های بافت تازه جمع آوری شده استفاده کنید.

2. انجماد و ذوب مکرر نمونه های بافت.

   پیشنهاد: هنگام نگهداری نمونه‌های بافت، بهتر است آن‌ها را برای نگهداری به قطعات کوچک برش دهید و هنگام استفاده از آن‌ها بخشی از آن‌ها را خارج کنید تا از تخریب RNA ناشی از انجماد و ذوب مکرر نمونه‌ها جلوگیری شود.

3. RNase در اتاق عمل وارد می شود یا از دستکش یکبار مصرف، ماسک و غیره استفاده نمی شود.

   پیشنهاد: آزمایشات استخراج RNA بهتر است در عملیات RNA جداگانه انجام شود و میز آزمایشگاه باید قبل از آزمایش تمیز شود و در طول آزمایش از دستکش و ماسک یکبار مصرف استفاده شود تا از تخریب RNA ناشی از معرفی RNase تا حد زیادی جلوگیری شود.

4. معرف در طول استفاده توسط RNase آلوده می شود.

   پیشنهاد: با یک سری جدید از کیت های استخراج RNA کل گیاه برای آزمایش های مرتبط جایگزین کنید.

5. لوله های سانتریفیوژ و نوک پیپت های مورد استفاده برای دستکاری RNA به RNase آلوده هستند.

پیشنهاد: مطمئن شوید که لوله های سانتریفیوژ، نوک پیپت، پیپت ها و غیره مورد استفاده در استخراج RNA همگی فاقد RNase هستند.

دفترچه راهنما:

راهنمای دستورالعمل کیت جداسازی RNA توتال گیاهی