راهنمای تجزیه و تحلیل مسئله

در زیر تجزیه و تحلیل مشکلاتی است که ممکن است در استخراج DNA/RNA ویروسی با آن مواجه شوید، امید است که برای آزمایشات شما مفید باشد.علاوه بر این، برای سایر مشکلات تجربی یا فنی به غیر از دستورالعمل های عملیاتی و تجزیه و تحلیل مشکلات، ما پشتیبانی فنی را برای کمک به شما اختصاص داده ایم.در صورت نیاز با ما تماس بگیرید: 028-83360257 یا ایمیل:

Tech@foregene.com.

بدون استخراج اسید نوکلئیک یا بازده اسید نوکلئیک پایین

معمولاً عوامل زیادی بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارند، مانند: محتوای اسید نوکلئیک نمونه، روش عملیات، حجم شستشو و غیره.

تجزیه و تحلیل علل شایع:

1. یک حمام یخ یا سانتریفیوژ با دمای پایین (4 درجه سانتیگراد) در طول روش انجام شد.

پیشنهاد: در تمام مراحل در دمای اتاق (15-25 درجه سانتیگراد) کار کنید، از حمام یخ و سانتریفیوژ با دمای پایین خودداری کنید.

2. نمونه به طور نامناسب ذخیره شده یا نمونه برای مدت طولانی نگهداری شده است.

توصیه: نمونه ها را در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری کنید و از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.سعی کنید از نمونه های تازه جمع آوری شده برای استخراج اسید نوکلئیک استفاده کنید.

3. لیز نمونه ناکافی.

توصیه: لطفاً اطمینان حاصل کنید که نمونه و محلول کار لیز کاملاً مخلوط شده و در دمای اتاق (15-25 درجه سانتیگراد) به مدت 10 دقیقه انکوبه می شوند.

4. اضافه کردن نادرست شوینده.

پیشنهاد: مطمئن شوید که RNase-Free ddH2O به صورت قطره ای به وسط غشای ستون تصفیه اضافه شده است و آن را روی حلقه ستون تصفیه نریزید.

5. حجم صحیح اتانول مطلق به بافر RW2 اضافه نشده است.

پیشنهاد: لطفاً دستورالعمل ها را دنبال کنید، حجم صحیح اتانول مطلق را به بافر RW2 اضافه کنید و قبل از استفاده از کیت خوب مخلوط کنید.

6. حجم نمونه نامناسب.

پیشنهاد: 200 میکرولیتر نمونه برای هر 500 میکرولیتر بافر DRL پردازش می شود.پردازش بیش از حد نمونه منجر به بازده استخراج اسید نوکلئیک کمتر می شود.

7. حجم شستشو نامناسب یا شستشوی ناقص.

توصیه: حجم شوینده ستون تصفیه 30-50μl است.اگر اثر شستشو رضایت بخش نباشد، توصیه می شود پس از افزودن ddH2O بدون RNase از قبل گرم شده، مانند 5-10 دقیقه، زمان را در دمای اتاق افزایش دهید.

8. اتانول پس از شستشو با بافر RW2 روی ستون باقی می ماند.

پیشنهاد: اگر اتانول پس از سانتریفیوژ با بافر RW2 به مدت 2 دقیقه باقی بماند، می توان ستون را به مدت 5 دقیقه پس از سانتریفیوژ در دمای اتاق قرار داد تا اتانول باقیمانده به طور کامل حذف شود.

اسید نوکلئیک خالص شده تجزیه می شود

کیفیت اسید نوکلئیک خالص شده با حفظ نمونه، آلودگی RNase، عملکرد و عوامل دیگر مرتبط است.تجزیه و تحلیل علل شایع:

1. نمونه های جمع آوری شده به موقع نگهداری نشدند.

پیشنهاد: اگر نمونه پس از جمع آوری به موقع استفاده نشد، لطفاً بلافاصله آن را در دمای -80 درجه سانتیگراد در دمای پایین نگهداری کنید.برای استخراج RNA سعی کنید از نمونه های تازه جمع آوری شده استفاده کنید.

2. نمونه ها را جمع آوری کنید و به طور مکرر منجمد و ذوب کنید.

پیشنهاد: از انجماد و ذوب (بیش از یک بار) در طول جمع آوری و نگهداری نمونه ها خودداری کنید، در غیر این صورت بازده اسید نوکلئیک کاهش می یابد.

3. RNase در اتاق عمل وارد می شود یا از دستکش، ماسک و ... یکبار مصرف استفاده نمی شود.

توصیه: آزمایش‌های استخراج RNA بهتر است در اتاق عمل جداگانه RNA انجام شود و میز آزمایشگاه باید قبل از آزمایش تمیز شود.

در طول آزمایش از دستکش و ماسک یکبار مصرف استفاده کنید تا از تخریب RNA ناشی از معرفی RNase تا حد زیادی جلوگیری کنید.

4. معرف در طول استفاده با RNase آلوده شد.

توصیه: برای آزمایش‌های مرتبط با کیت جداسازی DNA/RNA ویروسی جدید جایگزین کنید.

5. لوله های سانتریفیوژ و نوک پیپت های مورد استفاده برای دستکاری RNA به RNase آلوده هستند.

پیشنهاد: مطمئن شوید که لوله های سانتریفیوژ، نوک پیپت، پیپت ها و غیره مورد استفاده برای استخراج RNA همگی فاقد RNase هستند.

اسید نوکلئیک تصفیه شده بر آزمایشات پایین دست تأثیر می گذارد

DNA و RNA خالص شده توسط ستون خالص سازی، اگر محتوای یون نمک و پروتئین بیش از حد بالا باشد، آزمایشات پایین دستی را تحت تأثیر قرار می دهد، مانند: تقویت PCR، رونویسی معکوس و غیره.

1. DNA و RNA شسته شده دارای یون های نمک باقی مانده هستند.

پیشنهاد: مطمئن شوید که حجم صحیح اتانول مطلق به بافر RW2 اضافه شده است و ستون تصفیه را دو بار با سرعت سانتریفیوژ مشخص شده در دستورالعمل های عملیاتی بشویید.سانتریفیوژ را برای به حداقل رساندن آلودگی یون نمک انجام دهید.

2. DNA و RNA شسته شده دارای بقایای اتانول هستند.

پیشنهاد: پس از تایید شستشو با بافر RW2، سانتریفیوژ لوله خالی را با سرعت سانتریفیوژ در دستورالعمل های عملیاتی انجام دهید.اگر هنوز باقی مانده اتانول وجود دارد، می توانید لوله خالی را سانتریفیوژ کرده و سپس آن را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا باقی مانده اتانول تا حد زیادی از بین برود.

دفترچه راهنما:

راهنمای دستورالعمل کیت جداسازی DNA&RNA ویروسی