اخبار - تفسیری جامع از نکات کلیدی تست نوکلئیک اسید SARS-CoV-2، چرا منفی کاذب و آزمایش مجدد مثبت وجود دارد؟

در مراحل اولیه شیوع، به دلیل توسعه سریع، تشخیص سریع بیماران مشکوک، کلید پیشگیری از COVID-19 است.برخی از معرف‌های تشخیص اسید نوکلئیک تایید شده زمان توسعه کوتاهی دارند و مشکلاتی مانند تأیید عملکرد عجولانه، بهینه‌سازی ناکافی معرف و تفاوت‌های زیاد بین دسته‌ها وجود دارد.مشکلات آزمایشگاه‌های بالینی مختلف در جنبه‌های مختلف فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک نیز ممکن است بر دقت نتایج تشخیص نوکلئیک اسید تأثیر بگذارد.این مقاله بر روی پیوندها و نکات کلیدی در تشخیص فعلی اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 تمرکز می‌کند و مشکلات بررسی مجدد منفی و مثبت کاذب تشخیص اسید نوکلئیک آزمایشگاهی و ناسازگاری بالینی را تحلیل می‌کند.

اصول تشخیص SARS-CoV-2 اسید نوکلئیک

SARS-CoV-2 یک ویروس RNA با توالی ژنومی حدود 29 کیلوبایت، با 10 ژن است که می تواند به طور موثر 10 پروتئین را رمزگذاری کند.ویروس ها از RNA و پروتئین تشکیل شده اند و بیرونی ترین لایه یک پوشش بیرونی است که از لیپیدها و گلیکوپروتئین ها تشکیل شده است.در داخل، کپسید پروتئین، RNA را در آن می پیچد و در نتیجه از RNA به راحتی تجزیه پذیر (P1) محافظت می کند.

ساختار P1 SARS-COV-2

ویروس ها از طریق گیرنده های سطح سلولی خاص به سلول ها حمله می کنند تا عفونت ایجاد کنند و از سلول های میزبان برای تکثیر استفاده می کنند.

اصل تشخیص اسید نوکلئیک ویروسی این است که RNA ویروسی را از طریق لیزات سلولی در معرض دید قرار دهیم و سپس از واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس فلورسنت بلادرنگ (RT-PCR) برای تشخیص استفاده کنیم.

کلید اصل تشخیص استفاده از پرایمرها و پروب ها برای دستیابی به "تطابق هدفمند" توالی های اسید نوکلئیک است، یعنی یافتن توالی اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 که با سایر ویروس ها در حدود 30000 باز متفاوت است (شباهت اسید نوکلئیک به سایر ویروس ها) منطقه "پایین" و پروب ها)، طراحی.

پرایمرها و کاوشگرها به شدت با ناحیه خاص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 مطابقت دارند، یعنی ویژگی بسیار قوی است.هنگامی که نتیجه تقویت بلادرنگ RT-PCR فلورسنت نمونه مورد آزمایش مثبت شد، ثابت می‌کند که SARS-CoV-2 در نمونه وجود دارد.P2 را ببینید.

P2 مراحل تعیین اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (RT-PCR فلورسنت بلادرنگ)

شرایط و الزامات آزمایشگاه برای تشخیص SARS-CoV-2 اسید نوکلئیک

آزمایشگاه‌های آزمایش اسید نوکلئیک ایده‌آل‌ترین آزمایشگاه‌ها برای محیط‌های با فشار منفی هستند و باید به نظارت بر فشار، حفظ جریان هوا و حذف آئروسل‌ها توجه کنند.پرسنل تست اسید نوکلئیک باید صلاحیت های مربوطه را داشته باشند، آموزش واکنش زنجیره ای پلیمراز مربوطه را دریافت کرده و ارزیابی را پشت سر بگذارند.آزمايشگاه بايد به شدت مديريت شود، در محل قرار گيرد، و ورود پرسنل نامربوط به شدت ممنوع است.منطقه تمیز باید تهویه و در محل ضد عفونی شود.اقلام مربوطه در مناطق قرار می گیرند، تمیز و کثیف از هم جدا می شوند، به موقع تعویض می شوند و در محل ضد عفونی می شوند.ضدعفونی معمولی: محلول ضدعفونی کننده حاوی کلر محلول اصلی برای مناطق بزرگتر است و می توان از الکل 75 درصد برای مناطق کوچک استفاده کرد.یک راه خوب برای مقابله با آئروسل ها باز کردن پنجره ها برای تهویه است و همچنین می توان ضد عفونی هوا را با استفاده از اشعه ماوراء بنفش، فیلتراسیون و ضد عفونی هوا انجام داد.

پیوندها و پارامترهای کلیدی تعیین اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (RT-PCR فلورسنت بلادرنگ)

اگرچه آزمایشگاه ها به طور کلی به "تشخیص اسید نوکلئیک" توجه زیادی می کنند، در واقع "استخراج" اسید نوکلئیک نیز یکی از مراحل کلیدی برای تشخیص موفقیت آمیز است که ارتباط نزدیکی با جمع آوری و ذخیره نمونه های ویروس دارد.

در حال حاضر پرمصرف ترین نمونه های تنفسی مانند سواب نازوفارنکس از روش دوم استفاده می کنند که محلول غیرفعال سازی (نگهداری) تهیه شده بر اساس محلول استخراج و لیز اسید نوکلئیک است.از یک طرف، این محلول حفظ ویروس می تواند پروتئین ویروس را دناتوره کند، فعالیت خود را از دست بدهد و دیگر عفونی نباشد، و ایمنی مرحله انتقال و تشخیص را بهبود بخشد.از سوی دیگر، می تواند مستقیماً ویروس را بشکند تا اسید نوکلئیک آزاد کند، آنزیم تجزیه کننده اسید نوکلئیک را از بین ببرد و از ویروس جلوگیری کند.RNA تجزیه می شود.

محلول نمونه برداری ویروس که بر اساس محلول لیز استخراج اسید نوکلئیک تهیه شده است.اجزای اصلی عبارتند از نمکهای متعادل، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید، نمک گوانیدین (گوانیدین ایزوتیوسیانات، گوانیدین هیدروکلراید و غیره)، سورفکتانت آنیونی (دودکان)، سولفات سدیم)، سورفاکتانت کاتیونی (تترادسیل تری متیل آمونیوم 8، دی تینولوکس، دی تری متیل آمونیوم، دی تینولوکس، دی کوئیولوکس، پروتئین 8. ase K و چندین یا چند جزء دیگر.در حال حاضر، انواع مختلفی از کیت های استخراج اسید نوکلئیک وجود دارد و از معرف های مختلف استخراج و تصفیه اسید نوکلئیک استفاده می شود.حتی اگر از همان معرف استخراج و تصفیه اسید نوکلئیک استفاده شود، مراحل استخراج هر کیت متفاوت است.

در حال حاضر، محصولات کیت تشخیص نوکلئیک اسید تایید شده توسط اداره ملی محصولات پزشکی بر اساس ژن‌های ORF1ab، E و N در ژنوم SARS-CoV-2 انتخاب می‌شوند.اصول تشخیص محصولات مختلف اساساً یکسان است، اما پرایمرها و طراحی پروب آنها متفاوت است.بخش‌های تک هدف (ORF1ab)، بخش‌های هدف دوگانه (ORF1ab، N یا E) و بخش‌های سه هدف (ORF1ab، N و E) وجود دارد.تفاوت بین تشخیص و تفسیر، استخراج اسید نوکلئیک و سیستم واکنش فلورسنت RT-PCR بلادرنگ باید به دستورالعمل‌های کیت مربوطه مراجعه کند و توصیه می‌شود که کاربران به شدت از روش تفسیر مشخص شده در دستورالعمل‌های کیت برای تفسیر پیروی کنند.نواحی مشترک، پرایمرها و توالی های پروب تقویت شده توسط RT-PCR فلورسنت بلادرنگ در P3 نشان داده شده است.

P3 محل آمپلیکون هدف SARS-CoV-2 روی ژنوم و توالی پرایمرها و کاوشگرها

تفسیر نتایج تعیین اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (Real-TIM فلورسنت RT-PCR)

"طرح پیشگیری و کنترل پنومونی برای عفونت SARS-CoV-2 (ویرایش دوم)" برای اولین بار معیارهای قضاوت در مورد نتایج تکثیر ژنی را روشن کرد:

1. هیچ Ct یا Ct≥40 منفی است.

2. Ct<37 مثبت است.

3. مقدار Ct 37-40 ناحیه مقیاس خاکستری است.تکرار آزمایش توصیه می شود.اگر نتیجه انجام مجدد Ct<40 و منحنی تقویت دارای پیک های واضح باشد، نمونه مثبت و در غیر این صورت منفی ارزیابی می شود.

ویرایش سوم راهنما و ویرایش چهارم راهنما معیارهای فوق را ادامه دادند.با این حال، با توجه به اهداف مختلف مورد استفاده در کیت های تجاری، ویرایش 3 فوق الذکر معیارهایی را برای تعیین ترکیب اهداف ارائه نکرده است، با تاکید بر دستورالعمل های ارائه شده توسط سازنده.با شروع از ویرایش پنجم دستورالعمل، دو هدف مشخص شده است، به ویژه معیارهای قضاوت برای یک هدف واحد که قضاوت آن دشوار است.یعنی اگر آزمایشگاه بخواهد تایید کند که موردی برای تشخیص نوکلئیک اسید SARS-CoV-2 مثبت است، باید 1 از 2 شرط زیر را داشته باشد:

(1) دو هدف SARS-CoV-2 (ORF1ab، N) در یک نمونه توسط RT-PCR فلورسنت بلادرنگ مثبت شدند.اگر یک هدف مثبت باشد، نمونه برداری مجدد و آزمایش مجدد مورد نیاز است.اگر نتایج آزمایش باشد اگر هدف واحد هنوز مثبت باشد، مثبت ارزیابی می شود.

(2) دو نمونه از RT-PCR فلورسنت بلادرنگ یک هدف مثبت را در همان زمان نشان دادند یا دو نمونه از یک نوع یک نتیجه آزمایش مثبت یک هدف را نشان دادند که می‌توان آن را مثبت ارزیابی کرد.با این حال، دستورالعمل ها همچنین تأکید می کنند که نتایج منفی آزمایش اسید نوکلئیک نمی تواند عفونت SARS-CoV-2 را رد کند.عواملی که ممکن است باعث منفی کاذب شوند باید حذف شوند، از جمله کیفیت پایین نمونه (نمونه های تنفسی از اوروفارنکس و سایر قسمت ها)، جمع آوری نمونه خیلی زود یا خیلی دیر، نمونه ها به درستی ذخیره، حمل و نقل و پردازش نشدند، و خود فناوری مشکلاتی داشت (تنوع ویروس، مهار PCR) و غیره.

علل منفی کاذب در تشخیص SARS-CoV-2

مفهوم «منفی کاذب» در آزمایش اسید نوکلئیک که در حال حاضر مورد توجه است، اغلب به «منفی کاذب» اشاره دارد که در آن نتایج آزمایش اسید نوکلئیک با تظاهرات بالینی ناسازگار است، یعنی علائم بالینی و نتایج تصویربرداری به شدت مشکوک به COVID-19 هستند، اما آزمایش‌های اسید نوکلئیک همیشه «منفی» هستند.مرکز آزمایشگاهی بالینی کمیسیون بهداشت ملی آزمایش "منفی کاذب" SARS-CoV-2 را توضیح داد.

(1) مقدار مشخصی ویروس در سلول های فرد مبتلا وجود دارد.داده های موجود نشان می دهد که پس از آلوده شدن بدن به ویروس، ویروس از طریق بینی و دهان وارد گلو شده و سپس به نای و برونش ها وارد می شود و سپس به آلوئول ها می رسد.فرد مبتلا دوره کمون، علائم خفیف و سپس روند علائم شدید و مراحل مختلف بیماری را تجربه خواهد کرد.و میزان ویروس موجود در نقاط مختلف بدن متفاوت است.

از نظر بار ویروسی انواع سلول ها، سلول های اپیتلیال آلوئولار (دستگاه تنفسی تحتانی)> سلول های اپیتلیال راه هوایی (دستگاه تنفسی فوقانی)> فیبروبلاست ها، سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها و غیره.از نوع نمونه، مایع لاواژ آلوئولی (عالی ترین)> خلط سرفه عمیق> سواب نازوفارنکس> سواب اوروفارنکس> خون.علاوه بر این، ویروس را می توان در مدفوع نیز تشخیص داد.با این حال، با توجه به راحتی عمل و پذیرش بیماران، سفارش نمونه بالینی معمول مورد استفاده، سواب اوروفارنکس> سواب نازوفارنکس> مایع لاواژ برونش (عملیات پیچیده) و خلط عمیق (معمولاً سرفه خشک، به سختی بدست می آید) است.

بنابراین، میزان ویروس در سلول های اوروفارنکس یا نازوفارنکس برخی از بیماران کم یا به شدت کم است.اگر فقط نمونه هایی از اوروفارنکس یا نازوفارنکس برای آزمایش گرفته شود، اسید نوکلئیک ویروسی تشخیص داده نخواهد شد.

(2) هیچ سلول حاوی ویروس در طول نمونه برداری جمع آوری نشد، یا اسید نوکلئیک ویروسی به طور موثر حفظ نشد.

[① محل جمع آوری نامناسب، به عنوان مثال، هنگام جمع آوری سواب های اوروفارنکس، عمق جمع آوری کافی نیست، سواب های نازوفارنکس جمع آوری شده در عمق حفره بینی جمع آوری نمی شوند، و غیره. بیشتر سلول های جمع آوری شده ممکن است سلول های عاری از ویروس باشند.

②سواب های نمونه برداری اشتباه استفاده می شود.به عنوان مثال، الیاف مصنوعی مانند الیاف PE، الیاف پلی استر و الیاف پلی پروپیلن برای جنس سر سواب توصیه می شود.الیاف طبیعی مانند پنبه در عملیات واقعی استفاده می شود (جذب قوی پروتئین و شستشو آسان نیست) و الیاف نایلون (جذب ضعیف آب که منجر به حجم نمونه برداری ناکافی می شود).

③استفاده نادرست از لوله های ذخیره ویروس، مانند استفاده نادرست از لوله های ذخیره سازی پلی پروپیلن یا پلی اتیلن پلاستیکی که به راحتی اسیدهای نوکلئیک (DNA/RNA) را جذب می کنند، منجر به کاهش غلظت اسید نوکلئیک در محلول ذخیره سازی می شود.در عمل، استفاده از پلاستیک پلیمری پلی اتیلن-پروپیلن و برخی ظروف پلاستیکی پلی پروپیلن مخصوص تصفیه شده برای نگهداری اسیدهای نوکلئیک ویروسی توصیه می شود.]

(4) عملیات آزمایشگاهی بالینی استاندارد نیست.شرایط حمل و نقل و نگهداری نمونه، عملکرد استاندارد آزمایشگاه های بالینی، تفسیر نتایج و کنترل کیفیت عوامل کلیدی برای اطمینان از صحت و قابلیت اطمینان نتایج آزمایش هستند.بر اساس نتایج ارزیابی کیفیت خارجی که توسط مرکز آزمایشگاه بالینی کمیسیون بهداشت ملی در تاریخ 16-24 مارس 2020 انجام شد، از 844 آزمایشگاهی که نتایج معتبر دریافت کردند، 701 آزمایشگاه (83.1٪) واجد شرایط بودند و 143 (16.9٪) واجد شرایط نبودند.واجد شرایط، شرایط کلی آزمایش آزمایشگاهی خوب است، اما آزمایشگاه‌های مختلف هنوز در توانایی عملیات پرسنل، توانایی تفسیر نمونه مثبت تک هدف، و کنترل کیفیت تفاوت‌هایی دارند.

چگونه منفی کاذب تشخیص نوکلئیک اسید SARS-CoV-2 را کاهش دهیم؟

کاهش منفی کاذب در تشخیص اسید نوکلئیک باید از چهار جنبه تولید منفی کاذب بهینه شود.

(1) مقدار مشخصی ویروس در سلول های فرد آلوده وجود دارد.غلظت ویروس در قسمت های مختلف بدن افراد مشکوک به آلوده در زمان های مختلف متفاوت خواهد بود.اگر حلق وجود نداشته باشد، ممکن است در مایع لاواژ برونش یا مدفوع باشد.اگر بتوان چندین نوع نمونه را به طور همزمان یا در مراحل مختلف پیشرفت بیماری برای آزمایش جمع آوری کرد، به جلوگیری از منفی کاذب کمک می کند.

(2) سلول های حاوی ویروس باید در طول جمع آوری نمونه جمع آوری شوند.با تقویت آموزش نمونه گیران می توان این مشکل را تا حدود زیادی حل کرد.

(3) معرف های IVD قابل اعتماد.با انجام تحقیقات در مورد ارزیابی عملکرد تشخیص معرف ها در سطح ملی و بحث در مورد مشکلات موجود، می توان کارایی تشخیص معرف ها را بیشتر بهبود بخشید و حساسیت آنالیز را بهبود بخشید.

(4) عملکرد استاندارد آزمایشگاه های بالینی.با تقویت آموزش پرسنل آزمایشگاه، بهبود مستمر سیستم مدیریت کیفیت آزمایشگاه، حصول اطمینان از تقسیم بندی منطقی و ارتقاء توانایی پرسنل در تشخیص، می توان منفی های کاذب ناشی از عملکرد نامناسب آزمایشگاه را کاهش داد.

دلایل مثبت شدن مجدد تست نوکلئیک اسید SARS-CoV-2 در بیماران بهبودیافته و ترخیص شده

"برنامه تشخیص و درمان COVID-19 (نسخه هفتم آزمایش)" به وضوح تصریح می کند که یکی از معیارهای بیماران Covid-19 که از بیمارستان درمان می شود و از بیمارستان مرخص می شود ، این است که دو نمونه دستگاه تنفسی متوالی دارای یک آزمایش اسید نوکلئیک منفی (حداقل 24 ساعت از هم جدا) هستند ، اما تعداد بسیار کمی از آزمون های SARS-COV-2 وجود دارد.

(1) SARS-CoV-2 یک ویروس جدید است.درک بیشتر مکانیسم بیماریزای آن، تصویر کامل بیماری ایجاد شده و ویژگی های دوره بیماری ضروری است.بنابراین، از یک سو، تقویت مدیریت بیماران ترخیص شده و انجام نظارت پزشکی 14 روزه ضروری است.پیگیری، نظارت بر سلامت و راهنمایی های بهداشتی را برای عمیق تر کردن درک کل فرآیند وقوع، توسعه و نتیجه بیماری انجام دهید.

(2) ممکن است بیمار دوباره به ویروس آلوده شود.آکادمیسین ژونگ نانشان گفت: از آنجایی که بیماران درمان شده دارای آنتی بادی هستند، SARS-CoV-2 را می توان در صورت تهاجم مجدد با آنتی بادی ها از بین برد.دلایل زیادی وجود دارد که ممکن است علت بهبودی بیمار باشد یا به جهش ویروس و یا حتی علت آزمایش آزمایشگاهی مربوط باشد.اگر این خود ویروس باشد، جهش SARS-CoV-2 ممکن است باعث شود که آنتی بادی تولید شده توسط بیمار بهبود یافته در برابر ویروس جهش یافته بی اثر باشد.اگر بیمار دوباره به ویروس جهش یافته آلوده شود، آزمایش اسید نوکلئیک ممکن است دوباره مثبت باشد.

(3) تا آنجا که به روش های آزمایش آزمایشگاهی مربوط می شود، هر روش آزمایش محدودیت های خود را دارد.تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 به دلیل انتخاب توالی ژن، ترکیب معرف‌ها، حساسیت روش و دلایل دیگر است که منجر به این می‌شود که کیت‌های موجود محدودیت‌های تشخیص پایین‌تری دارند.پس از درمان بیمار، ویروس در بدن کاهش می یابد.هنگامی که بار ویروسی در نمونه مورد آزمایش کمتر از حد پایین تشخیص باشد، یک نتیجه "منفی" ظاهر می شود.با این حال، این نتیجه به این معنی نیست که ویروس در بدن به طور کامل ناپدید شده است.ویروس ممکن است پس از قطع درمان باشد.Resurgence» به کپی کردن ادامه دهید.بنابراین توصیه می شود هفته ای یک بار طی 2 تا 4 هفته پس از ترخیص بررسی شود.

(4) اسید نوکلئیک ماده ژنتیکی ویروس است.ویروس پس از اینکه بیمار تحت درمان ضد ویروسی قرار گرفت، از بین می رود، اما قطعات RNA ویروسی باقی مانده هنوز در بدن انسان باقی می مانند و به طور کامل از بدن خارج نمی شوند.گاهی اوقات، تحت شرایط خاص، می توان آن را بیشتر حفظ کرد.برای مدت طولانی، و در این زمان، آزمایش اسید نوکلئیک "گذرا" مثبت خواهد بود.با طولانی شدن زمان بهبودی بیمار، پس از اتمام تدریجی قطعات RNA باقیمانده در بدن، نتیجه آزمایش اسید نوکلئیک می تواند منفی شود.

(5) نتیجه آزمایش اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 فقط وجود یا عدم وجود RNA ویروسی را اثبات می کند و نمی تواند فعالیت ویروس و قابل انتقال بودن ویروس را ثابت کند.باید ثابت شود که آیا بیماری که دوباره آزمایش اسید نوکلئیک مثبت می دهد، دوباره منبع عفونت می شود یا خیر.کشت ویروس روی نمونه های بالینی و کشت یک ویروس "زنده" برای اثبات عفونی بودن آن ضروری است.

خلاصه

به طور خلاصه نمی توان از منفی کاذب تست اسید نوکلئیک SARS-CoV-2، مثبت شدن مجدد تست و سایر شرایطی که با تظاهرات بالینی ناسازگار است اجتناب کرد.در غربالگری و آزمایش واقعی، ترکیب علائم بالینی، معاینات تصویربرداری (CT) و آزمایش‌ها نتایج آزمایش‌های آزمایشگاهی (تست اسید نوکلئیک + آزمایش آنتی‌بادی اختصاصی ویروس) برای تشخیص جامع توصیه می‌شود تا از تشخیص نادرست و تشخیص اشتباه جلوگیری شود.اگر نتایج آزمایش آشکارا با تظاهرات بالینی مغایرت داشته باشد، توصیه می‌شود که یک تجزیه و تحلیل جامع از کل پیوند آزمایش (جمع‌آوری نمونه، پیوندهای گردش خون و پردازش) انجام شود تا عفونت اولیه ویروس SARS-CoV-2، عفونت مکرر یا ترکیب با سایر عفونت‌های ویروسی تنفسی و غیره ممکن نباشد.اگر شرایط اجازه می دهد، توصیه می شود نمونه های حساس تری مانند خلط یا مایع شستشوی آلوئولار برای بررسی مجدد جمع آوری شود.

محصولات مرتبط:

کیت تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (روش پروب فلورسنت PCR Multiplex)

زمان ارسال: سپتامبر-03-2021