نویسندگان: وانگ شیائویان، ژائو اریو

واحد: بیمارستان Jiaozhou، بیمارستان Dongfang وابسته به دانشگاه Tongji

در حال حاضر، نمونه اصلی برای تشخیص اسید نوکلئیک پاتوژن تنفسی، سواب گلو است.انواع مختلفی از محلول‌های نگهداری نمونه معمولی وجود دارد که همگی برای حمل و نقل و نگهداری باید در یخچال یا منجمد شوند.کنترل کل فرآیند دمای پایین در طول فرآیند جمع آوری و حمل و نقل دشوار است و اطمینان از کنترل کیفیت قبل از آزمایش نمونه دشوار است.^[1-2].

RNase (RNase) یک اندونوکلئاز است که RNA را هیدرولیز می کند و عمدتاً پیوندهای فسفودی استری بین نوکلئوتیدها را قطع می کند.مولکول RNase بسیار پایدار است، پیوندهای دی سولفیدی در ساختار وجود دارد و فعالیت آن نیازی به حضور کاتیون‌های دو ظرفیتی ندارد، بنابراین RNase به راحتی دناتوره نمی‌شود و حتی پس از دمای بالا یا استفاده از مواد دناتوره‌کننده به راحتی قابل تغییر است.RNase ها به دو دسته درون زا و اگزوژن تقسیم می شوند.RNase های درون زا می توانند همزمان با پاره شدن سلول ها آزاد شوند.بنابراین، حذف نقش RNaseهای درون زا یک مرحله بسیار مهم در فرآیند استخراج RNA است.RNaseهای اگزوژن به طور گسترده ای توزیع شده اند.RNase ها در هوا، پوست، مو و بزاق انسان وجود دارند که دلایل مهمی برای تجزیه آسان RNA هستند.^[3].

پرس و جو داده ها

CANS-CL02-A009 «کاربرد دستورالعمل‌های اعتباربخشی کیفیت و صلاحیت آزمایشگاهی پزشکی در زمینه تشخیص مولکولی» در الزامات فنی پیشنهاد می‌کند که استانداردهای مناسب کیفیت آب باید بر اساس کاربرد تدوین شود.ظروف یکبار مصرف بدون هوا:

RNase/طبقه بندی

(1) RNase A

ریبونوکلئاز A (RNase A)، مشتق شده از لوزالمعده گاو، یک اندوریبونوکلئاز است که می تواند به طور خاص به انتهای 3' باقی مانده پیریمیدین روی RNA حمله کند، سیتوزین یا اوراسیل را که توسط نوکلئوتیدهای مجاور تشکیل شده است را برش دهد.پیوند فسفودی استر، محصول نهایی واکنش یک نوکلئوتید پیریمیدین 3 و یک الیگونوکلئوتید با یک نوکلئوتید پیریمیدین 3 در انتهای آن است.

(2) RNase T1

ریبونوکلئاز T1 (RNase T1) از Aspergillus orjzae مشتق شده است، به طور خاص بر روی فسفات 3' انتهایی گوانین اثر می‌کند و محل برش بین 3' فسفات گوانین و 5' هیدروکسیل نوکلئوتیدهای مجاور است.محصول نهایی واکنش 3'گوانیلیک اسید و قطعات الیگونوکلئوتیدی با اسید 3'گوانیلیک در انتها است.

(3) RNase H

ریبونوکلئاز H (RNase H) اولین بار از بافت تیموس گوساله کشف شد و ژن کد کننده آن در اشریشیا کلی کلون شد.به طور خاص می تواند DNA را تجزیه کند: رشته های RNA در دوبلکس های هیبریدی RNA، در نتیجه الیگونوکلئوتیدها و مونونوکلئوتیدهایی با انتهای 3'-OH و 5'-مونوفسفات می شود، نمی تواند DNA یا RNA تک یا دو رشته ای را تجزیه کند.

RNase

عملکرد و استفاده

ریبونوکلئاز می تواند تجزیه اسید ریبونوکلئیک (RNA) را کاتالیز کند و می تواند به طور مصنوعی سنتز شود.پماد دارویی به صورت موضعی برای درمان ضربه و درد مفاصل استفاده می شود.بر اساس گزارش ها، ریبونوکلئاز می تواند متابولیسم سلول میزبان را تغییر دهد، سنتز ویروس را مهار کند، از تکثیر ویروس آنفولانزا در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند، و از تشکیل واکسینیا و ویروس تبخال در جنین مرغ جلوگیری کند.استفاده بالینی از ریبونوکلئاز تزریق عضلانی روزانه 180 میلی گرم، مفید برای درمان آنسفالیت اپیدمی، ریبونوکلئاز می تواند تجزیه اسید ریبونوکلئیک (RNA) را کاتالیز کند و اکنون می تواند به طور مصنوعی سنتز شود.پماد دارویی به صورت موضعی برای درمان ضربه و درد مفاصل استفاده می شود.بر اساس گزارش ها، ریبونوکلئاز می تواند متابولیسم سلول میزبان را تغییر دهد، سنتز ویروس را مهار کند، از تکثیر ویروس آنفولانزا در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند، و از تشکیل واکسینیا و ویروس تبخال در جنین مرغ جلوگیری کند.استفاده بالینی از ریبونوکلئاز تزریق عضلانی روزانه 180 میلی گرم برای درمان آنسفالیت اپیدمی مفید است.

RNase

تعریف بازدارنده

تعریف واحد بازدارنده RNase: مقدار آنزیم مورد نیاز برای مهار 50 درصد از فعالیت 5ng RNase A یک واحد است.

مهارکننده های RNase چگونه کار می کنند

ایزوتیوسیانات گوانیدین:

گوانیدین ایزوتیوسیانات یک ترکیب آلی با فرمول مولکولی C2H6N4S است.عمدتاً در پزشکی بیولوژیکی، معرف های شیمیایی و غیره استفاده می شود. ایزوتیوسیانات گوانیدین یک عامل لیز کننده پروتئین است و اغلب به عنوان جزء اصلی محلول لیز در معرف های تشخیصی مولکولی استفاده می شود.می تواند بافت را لیز کند، ساختار سلولی را از بین ببرد و اسید نوکلئیک را از نوکلئوپروتئین جدا کند و دناتوراسیون قوی به RNase دارد.در حال حاضر موثرترین مهارکننده RNase است.

TRIZol یک معرف جدید استخراج RNA کل است که می تواند به طور مستقیم RNA کل را از سلول ها یا بافت ها استخراج کند.این ماده حاوی موادی مانند فنل و گوانیدین ایزوتیوسیانات است که می تواند به سرعت سلول ها را مختل کرده و نوکلئازهای آزاد شده توسط سلول ها را مهار کند.

(با این حال، ایزوتیوسیانات گوانیدین برای سلامتی محققان آزمایشگاهی خطرناک است.)

RNasin:

گلیکوپروتئین اسیدی استخراج شده از کبد موش صحرایی یا بلاستودرم انسان.Rnasin یک مهار کننده غیر رقابتی RNase است که می تواند به RNase های مختلف متصل شود تا آنها را غیرفعال کند.

(جزئیات بیشتر: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hدمای بالا:

دمای بالا نیز یکی از ابزارهای رایج دناتوره کردن پروتئین است.

دی اتیل پیروکربنات (DEPC):

DEPC یک مهارکننده قوی اما ناقص RNase است که می تواند فعالیت RNase را با ترکیب با آمینو اسید ایمیدازول حلقه گروه فعال RNase برای دناتوره کردن پروتئین ها مهار کند.

کمپلکس ریبونوکلئوزیدی وانادیل:

کمپلکسی که توسط یون‌های اکسید وانادیم و نوکلئوزیدها تشکیل می‌شود که به شکل مواد انتقالی به RNase متصل می‌شود که می‌تواند تقریباً به طور کامل فعالیت RNase را مهار کند.

دیگر:

SDS، اوره، خاک دیاتومه و غیره نیز اثر بازدارندگی خاصی بر روی RNase دارند.

بررسی های تخصصی

لی یوجی، تکنسین ارشد

مدیر بخش آزمایشگاه، بیمارستان Jiaozhou، بیمارستان Dongfang وابسته به دانشگاه Tongji

به منظور جلوگیری از تجزیه زیستی RNase اگزوژن، ماسک، دستکش و کلاه باید در طول فرآیند استخراج RNA به طور مکرر پوشیده و جایگزین شوند.تمام ظروف شیشه ای باید در فر خشک کن با دمای 200 درجه سانتیگراد به مدت بیش از 2 ساعت پخته شوند.مواد مورد استفاده برای پخت، مانند پلاستیک، باید با آب DEPC تصفیه شوند و سپس با آب مقطر شسته شوند.معرف‌ها یا دستگاه‌هایی که برای استخراج، حفظ و شناسایی RNA استفاده می‌شوند باید به RNA اختصاص داده شوند و یک منطقه عملیات مستقل RNA باید ایجاد شود.

منابع:

[1] Smith-Vaughan HC، Binks MJ، Beissbarth J، و همکاران.باکتری ها و ویروس ها در نازوفارنکس بلافاصله قبل از شروع عفونت های حاد تنفسی تحتانی در کودکان بومی استرالیا [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] شعبه کنترل عفونت بیمارستانی انجمن پزشکی پیشگیرانه چین.راهنمای جمع آوری و بازرسی نمونه های میکروبی بالینی [J].مجله چینی عفونت بیمارستانی، 2018 (20): 3192-3200.

[3] "تست بالینی حجم تست بیولوژی مولکولی ده هزار چرا"