بررسی عملکرد پرایمرها و پروبها در مراحل اولیه معرفهای PCR و تعیین مناسبترین شرایط واکنش، پیشنیازهایی برای اطمینان از پیشرفت روان آزمایشهای رسمی است.
بنابراین چگونه باید پروب پرایمر را در مراحل اولیه تأیید کنیم؟
شاخص های اصلی عبارتند از: خط پایه، منحنی تقویت، مقدار ct، بازده تقویت، تشخیص نمونه با غلظت پایین، CV و غیره.
خط مبنا
خط پایه خط افقی در منحنی تقویت PCR است.در چند سیکل اول واکنش تقویت PCR، سیگنال فلورسانس تغییر چندانی نمی کند و یک خط مستقیم را تشکیل می دهد.این خط مستقیم خط مبنا است.
هنگام غربالگری پروب های پرایمر PCR، به سطح بودن خط پایه توجه کنید.خلوص غلظت پروب پرایمر بر روی خط پایه تأثیر می گذارد، مانند افزایش یا کاهش خط پایه.خط مبنا نیز یک شاخص بسیار بصری است.
منحنی تقویت
یکی دیگر از شاخص های بصری شکل منحنی تقویت است.بهتر است منحنی S شکل داشته باشید تا از تقویت ثانویه یا سایر منحنی های تقویت غیر طبیعی جلوگیری شود.
مقدار Ct
تعداد چرخه های مربوط به نقطه عطف از خط پایه تا رشد نمایی مقدار Ct است.
برای یک نمونه، پروبهای پرایمر مختلف منجر به منحنیهای تقویت متفاوت میشوند و مقدار Ct مربوطه تحتتاثیر بازده تقویت و درجه تداخل قرار میگیرد.در تئوری، هر چه مقدار Ct پروب پرایمری که انتخاب می کنیم کمتر باشد، بهتر است.
راندمان تقویت
یکی از مطمئن ترین و پایدارترین روش ها برای ارزیابی راندمان تقویت PCR، منحنی استاندارد است که به طور گسترده توسط محققان نیز شناخته شده است.این روش شامل ساخت یک سری نمونه برای کنترل تعداد نسبی الگوهای هدف است.این نمونهها معمولاً با رقتهای سریالی محلولهای استوک غلیظ ساخته میشوند که متداولترین مورد استفاده رقت 10 برابری است.با استفاده از یک سری نمونه های رقیق شده، با استفاده از برنامه qPCR استاندارد برای تقویت برای به دست آوردن مقدار Cq و در نهایت با رسم منحنی استاندارد با توجه به غلظت هر نمونه و مقدار Cq مربوطه، معادله خطی Cq= -klgX0+b و بازده تقویت E=10(-1/k)-1 به دست می آید.هنگام استفاده از qPCR برای تجزیه و تحلیل کمی، بازده تقویت باید در محدوده 90٪ -110٪ (3.6>k>3.1) باشد.
تشخیص نمونه با غلظت پایین
هنگامی که غلظت نمونه کم است، نرخ تشخیص پروب های پرایمر مختلف متفاوت است.ما 20 نمونه با غلظت کم را برای تکرار انتخاب می کنیم و سیستم پرایمر-کاوشگر با بالاترین نرخ تشخیص بهترین است.
ضریب تغییرات (CV)
10 نمونه تکراری را می توان با پروب های پرایمر مختلف مطابق با استاندارد خط معرف برای تشخیص تقویت اسید نوکلئیک شناسایی کرد.
معرف های کمی:
دقت
دقت در یک دسته باید برآورده شود: ضریب تغییرات (CV،٪) مقدار لگاریتمی غلظت آزمایش ≤5٪ است.هنگامی که غلظت نمونه کم است، ضریب تغییرات (CV،٪) لگاریتم غلظت تشخیص ≤10٪ است.
معرفهای کیفی:
دقت
دقت در یک دسته باید مطابق با:
(1) ضریب تغییرات مقدار Ct (CV،٪) ≤5٪
همان نمونه 10 بار به صورت موازی آزمایش می شود و نتایج آزمایش باید یکسان باشد
زمان ارسال: سپتامبر 18-2021