من معتقدم که همه افراد هنگام انجام واکنش‌های PCR همیشه با مشکلاتی از این قبیل مواجه می‌شوند، اما بیشتر آنها را می‌توان به دو مشکل اصلی طبقه‌بندی کرد:

تقویت خیلی کم الگوی ژن (تقویت)؛
تقویت بیش از حد ژن غیر هدف.
استفاده از مواد افزودنی یکی از راهکارهای رایج برای حل این مشکلات است.معمولاً نقش مواد افزودنی دو جنبه دارد:
ساختار ثانویهژن ها (ساختار ثانویه)؛
پرایمینگ غیر اختصاصی را کاهش دهید.
امروز ویرایشگر به طور خلاصه افزودنی های رایج در واکنش های PCR و عملکرد آنها را به شما معرفی می کند.
افزودنی هایی که ساختار ثانویه را کاهش می دهند
سولفوکسید(DMSO)
نمونه های ژنبا محتوای GC بالا.با این حال، DMSO نیز تا حد زیادی فعالیت پلیمراز Taq را کاهش می دهد.بنابراین، همه باید بین قابلیت دسترسی الگو و فعالیت پلیمراز تعادل برقرار کنند.ویرایشگر پیشنهاد می‌کند که می‌توانید غلظت‌های مختلف DSMO را امتحان کنید، مانند 2٪ تا 10٪، تا غلظت مناسب آزمایش خود را پیدا کنید.
شوینده های غیر یونی
شوینده های غیر یونی، مانند 1-0.1% Triton X-100، Tween 20 یا NP-40، معمولاً ساختار ثانویه DNA را کاهش می دهند.اگرچه این می تواند تقویت ژن الگو را افزایش دهد، اما باعث ایجاد مشکل در تقویت غیر اختصاصی می شود.بنابراین، این افزودنی‌ها برای واکنش‌های PCR کم بازده بدون باقی‌مانده به خوبی کار می‌کنند، اما برای واکنش‌های نسبتا ناخالص PRC چندان خوب نیستند.یکی دیگر از مزایای شوینده های غیر یونی کاهش آلودگی SDS است.معمولاً در طول فرآیند استخراج DNA، SDS به مرحله PCR آورده می‌شود که فعالیت پلیمراز را تا حد زیادی مهار می‌کند.بنابراین افزودن 0.5% Tween-20 یا Tween-40 به واکنش می تواند اثرات منفی SDS را خنثی کند.
بتائین_
بتائین می تواند تقویت DNA را با کاهش تشکیل ساختار ثانویه بهبود بخشد و به طور کلی یک افزودنی مرموز به کیت های PCR تجاری است.اگر می خواهید از بتائین استفاده کنید، باید بتائین یا بتائین مونو هیدرات (بتائین یا بتائین مونو هیدرات) را قرار دهید، اما نه بتائین هیدروکلراید (بتائین HCl) را روی غلظت نهایی 1-1.7M تنظیم کنید.بتائین همچنین می تواند به بهبود ویژگی کمک کند زیرا وابستگی ترکیب جفت باز ذوب DNA / دناتوره شدن DNA را حذف می کند.
افزودنی هایی برای کاهش پرایمینگ غیر اختصاصی
فرمامید
فرمامید یک افزودنی آلی PCR است که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرد.این می تواند با شیار اصلی و شیار جزئی در DNA ترکیب شود، در نتیجه پایداری مارپیچ دوگانه DNA اصلی را کاهش داده و دمای ذوب DNA را کاهش می دهد.غلظت فرمامید مورد استفاده در آزمایشات PCR معمولاً 1 تا 5 درصد است.
تترا متیلکلرید آمونیوم( TMAC)
کلرید تترا متیل آمونیوم می تواند ویژگی هیبریداسیون (ویژگی هیبریداسیون) را افزایش دهد و دمای ذوب DNA را افزایش دهد.بنابراین، TMAC می تواند پرایمینگ غیر اختصاصی را حذف کرده و اتصال نادرست DNA و RNA را کاهش دهد.اگر استفاده می کنیدآغازگرهای منحطدر واکنش PCR، به یاد داشته باشید که TMAC را اضافه کنید، که معمولاً در غلظت 15-100 میلی‌مولار استفاده می‌شود.
سایر افزودنی های رایج
علاوه بر دو دسته از افزودنی های ذکر شده در بالا، افزودنی های رایج زیادی در واکنش های PCR وجود دارد، اگرچه عملکردهای متفاوتی دارند، اما از اهمیت زیادی نیز برخوردارند.
یون منیزیم
یون منیزیم یک کوفاکتور (کوفاکتور) ضروری پلیمراز است، یعنی بدون یون منیزیم، پلیمراز غیر فعال است.با این حال، یون منیزیم بیش از حد نیز می تواند بر کارایی پلیمراز تأثیر بگذارد.غلظت یون منیزیم در هر واکنش PCR متفاوت خواهد بود.عوامل کیلیت (مانند EDTA یا سیترات)، غلظت dNTP ها و پروتئین ها همگی بر غلظت یون های منیزیم تأثیر می گذارند.بنابراین، اگر با آزمایش PCR خود مشکل دارید، می توانید سعی کنید غلظت های مختلف یون منیزیم را تغییر دهید، به عنوان مثال، از 1.0 به 4.0 میلی مولار، با فاصله بین 0.5-1 میلی مولار.
شایان ذکر است که چرخه های متعدد انجماد و ذوب می تواند منجر به طبقه بندی غلظت محلول کلرید منیزیم شود.بنابراین باید قبل از هر بار مصرف آن را کاملاً حل کنید و قبل از مصرف آن را خوب مخلوط کنید.
آلبومین سرم گاوی(آلبومین گاوی، BSA)
در آزمایشات شیمی مولکولی، آلبومین سرم گاوی یک افزودنی بسیار رایج است، به ویژه در هضم آنزیم محدود و آزمایشات PCR.در واکنش های PCR، BSA در کاهش آلاینده هایی مانند ترکیبات فنلی مفید است.و همچنین گفته می شود که می تواند چسبندگی واکنش دهنده ها را به دیواره لوله آزمایش کاهش دهد.در واکنش PCR، معمولاً غلظت BSA اضافه شده می تواند به 0.8 mg/ml برسد.
 
محصولات مرتبط:
قهرمان PCR(با رنگ)
قهرمان PCR