مقدار Ct مهمترین شکل ارائه نتیجه PCR کمی فلورسنت است.برای محاسبه تفاوت بیان ژن یا تعداد کپی ژن استفاده می شود.بنابراین، مقدار Ct در تعیین کمیت فلورسانس معقول در نظر گرفته می شود؟چگونه از محدوده موثر مقدار Ct اطمینان حاصل کنیم؟
Ct Value چیست؟
در طول فرآیند تقویت qPCR، تعداد سیکل های تقویت مربوطه (آستانه چرخه) زمانی که سیگنال فلورسانس محصول تقویت شده به آستانه فلورسانس تنظیم شده می رسد.C مخفف Cycle و T مخفف Threshold است.به بیان ساده، مقدار Ct تعداد چرخه های مربوط به زمانی است که تقویت الگوی اولیه به مقدار مشخصی محصول در qPCR می رسد.به اصطلاح "مقدار معینی از محصول" بعداً توضیح داده خواهد شد.
مقدار Ct چه کاری انجام می دهد؟
1-رابطه بین تقویت نمایی، مقدار الگو و مقدار Ct
در حالت ایده آل، ژن ها در qPCR با تقویت نمایی پس از تعداد معینی از چرخه ها جمع می شوند.رابطه بین تعداد چرخه های تقویت و مقدار محصولات به این صورت است: مقدار محصول تقویت شده = مقدار الگوی اولیه × (1+En) تعداد چرخه ها.با این حال، واکنش qPCR همیشه در یک وضعیت ایده آل نیست.هنگامی که مقدار محصول تقویت شده به "مقدار محصول معین" می رسد، تعداد چرخه ها در این زمان مقدار Ct است و در دوره تقویت نمایی است.رابطه بین مقدار Ct و مقدار شروع الگو: یک رابطه خطی بین مقدار Ct الگو و لگاریتم شماره کپی اولیه الگو وجود دارد.هر چه غلظت اولیه قالب بیشتر باشد، مقدار Ct کوچکتر است.هرچه غلظت اولیه قالب کمتر باشد، مقدار Ct بزرگتر است.
2. منحنی تقویت، آستانه فلورسانس و مقدار مشخصی محصول PCR
مقدار محصول تقویت qPCR به طور مستقیم به شکل سیگنال فلورسنت، یعنی منحنی تقویت ارائه می شود.در مرحله اولیه PCR، تقویت تحت شرایط ایده آل است، تعداد چرخه ها کم است، تجمع محصول کم است و سطح فلورسانس را نمی توان به وضوح از پس زمینه فلورسانس تشخیص داد.پس از آن، فلورسانس افزایش می یابد و وارد فاز نمایی می شود.مقدار محصول PCR را می توان در یک نقطه مشخص زمانی که واکنش PCR فقط در فاز نمایی است شناسایی کرد که می توان از آن به عنوان "مقدار معینی محصول" استفاده کرد و محتوای اولیه قالب را می توان از این نتیجه گرفت.بنابراین، شدت سیگنال فلورسانس مربوط به مقدار مشخصی از محصول، آستانه فلورسانس است.
در مرحله آخر PCR، منحنی تقویت دیگر تقویت نمایی را نشان نمی دهد و وارد فاز خطی و فاز فلات می شود.
3. تکرارپذیری مقادیر Ct
هنگامی که چرخه PCR به عدد سیکل مقدار Ct می رسد، به تازگی وارد دوره تقویت نمایی واقعی شده است.در این زمان، خطای کوچک تقویت نشده است، بنابراین تکرارپذیری مقدار Ct عالی است، یعنی همان قالب در زمان های مختلف یا در لوله های مختلف به طور همزمان تقویت می شود.با تقویت، مقدار Ct به دست آمده ثابت است.
1. راندمان تقویت En
کارایی تقویت PCR به کارایی اطلاق می شود که پلیمراز با آن ژن مورد نظر را به یک آمپلیکون تبدیل می کند.بازده تقویت زمانی که یک مولکول DNA به دو مولکول DNA تبدیل می شود 100٪ است.راندمان تقویت معمولاً به صورت En بیان می شود.به منظور تسهیل در تحلیل مقالات بعدی، عوامل موثر بر راندمان تقویت به اختصار معرفی می شوند.
| عوامل تاثیرگذار | توضیح | چگونه قضاوت کنیم؟ |
| A. مهارکننده های PCR | 1. DNA الگو حاوی موادی است که واکنش PCR را مهار می کنند، مانند پروتئین ها یا مواد شوینده.2. cDNA پس از رونویسی معکوس حاوی غلظت بالایی از RNA الگو یا اجزای معرف RT است که ممکن است واکنش PCR بعدی را نیز مهار کند. | 1. وجود آلودگی را می توان با اندازه گیری نسبت A260/A280 و A260/A230 یا الکتروفورز RNA قضاوت کرد.2. آیا cDNA بر اساس نسبت معینی پس از رونویسی معکوس رقیق می شود یا خیر. |
| ب- طراحی نامناسب پرایمر | پرایمرها به طور موثر بازپخت نمی شوند | پرایمرها را از نظر وجود دایمرهای پرایمر یا سنجاق سر، عدم تطابق و گاهی اوقات طرح‌های درونی پوششی بررسی کنید. |
| ج. طراحی نامناسب برنامه واکنش PCR | 1. پرایمرها نمی توانند به طور موثر بازپخت شوند2. آزادسازی ناکافی DNA پلیمراز 3. فعالیت طولانی مدت DNA پلیمراز در دمای بالا کاهش یافت | 1. دمای آنیل بالاتر از مقدار TM پرایمر است2. زمان قبل از دناتوراسیون خیلی کوتاه است 3. زمان هر مرحله از روش واکنش بیش از حد طولانی است |
| د- اختلاط ناکافی معرف ها یا خطاهای پیپتینگ | در سیستم واکنش، غلظت موضعی اجزای واکنش PCR خیلی زیاد یا ناهموار است، که منجر به تقویت غیر نمایی تقویت PCR می شود. | |
| E. طول آمپلیکون | طول آمپلیکون بیش از حد طولانی است، بیش از 300bp، و راندمان تقویت پایین است. | بررسی کنید که طول آمپلیکون بین 80-300bp باشد |
| F. تأثیر معرف های qPCR | غلظت DNA پلیمراز در معرف کم است یا غلظت یون ها در بافر بهینه نیست و در نتیجه فعالیت آنزیم Taq به حداکثر نمی رسد. | تعیین راندمان تقویت توسط منحنی استاندارد |
2. محدوده مقادیر Ct
مقادیر Ct از 15 تا 35 متغیر است.اگر مقدار Ct کمتر از 15 باشد، در نظر گرفته می شود که تقویت در محدوده دوره پایه است و آستانه فلورسانس به آن نرسیده است.در حالت ایده آل، یک رابطه خطی بین مقدار Ct و لگاریتم شماره کپی اولیه الگو، یعنی منحنی استاندارد وجود دارد.از طریق منحنی استاندارد، زمانی که راندمان تقویت 100٪ باشد، مقدار Ct محاسبه شده برای تعیین کمیت تعداد تک نسخه ژن حدود 35 است. اگر بیشتر از 35 باشد، تعداد کپی اولیه الگو از نظر تئوری کمتر از 1 است که می تواند بی معنی در نظر گرفته شود.
برای محدوده های مختلف Ct ژن، به دلیل تفاوت در تعداد کپی ژن و بازده تکثیر در مقدار الگوی اولیه، لازم است منحنی استاندارد برای ژن ایجاد شود و محدوده تشخیص خطی ژن محاسبه شود.
3. عوامل موثر بر مقدار Ct
از رابطه بین تعداد چرخه های تقویت و مقدار محصول: مقدار محصول تقویت شده = مقدار الگوی اولیه × (1+En) تعداد چرخه، می توان دریافت که در شرایط ایده آل، مقدار قالب اولیه و En تأثیر منفی بر مقدار Ct خواهد داشت.تفاوت در کیفیت قالب یا راندمان تقویت باعث می شود که مقدار Ct خیلی بزرگ یا خیلی کوچک باشد.
4. مقدار Ct خیلی بزرگ یا خیلی کوچک است
زمان ارسال: فوریه 22-2023
