PCR پرکاربردترین تکنولوژی تقویت اسید نوکلئیک است و به دلیل حساسیت و ویژگی آن بسیار مورد استفاده قرار می گیرد.با این حال، PCR نیاز به دناتوراسیون حرارتی مکرر دارد و نمی‌تواند از محدودیت‌های تکیه بر ابزار و تجهیزات خلاص شود، که کاربرد آن را در آزمایش‌های میدانی بالینی محدود می‌کند.

از اوایل دهه 1990، بسیاری از آزمایشگاه‌ها شروع به توسعه فناوری تقویت دمای ثابت کردند که نیازی به دناتوراسیون حرارتی ندارد.اکنون آنها فناوری تقویت همدما با واسطه حلقه، فناوری تقویت همدما جایگزین رشته، فناوری تقویت همدما دایره غلتشی و وابستگی توالی اسید نوکلئیک را توسعه داده اند.فناوری تقویت ایزوترمال و سایر فناوری ها. 

Lتقویت همدما با واسطه oop

اصل تقویت مبتنی بر این واقعیت است که DNA در حدود 65 درجه سانتیگراد در حالت تعادل دینامیکی قرار دارد.هنگامی که هر آغازگر به صورت جفت باز قرار می گیرد و به قسمت مکمل DNA دو رشته ای گسترش می یابد، رشته دیگر جدا شده و به تک رشته تبدیل می شود.

در این دما، DNA از 4 آغازگر خاص برای تکیه بر DNA پلیمراز با جابجایی رشته استفاده می کند تا سنتز DNA جابجایی رشته را به طور مداوم به گردش درآورد.

ابتدا 6 ناحیه خاص F3، F2، F1، B1، B2، B3 را روی ژن مورد نظر تعیین کنید و سپس بر اساس این 6 ناحیه خاص، 4 پرایمر طراحی کنید (مطابق شکل زیر):

پرایمر داخلی فوروارد (FIP) از F1c و F2 تشکیل شده است.

پرایمر داخلی عقب (BIP) از B1c و B2 تشکیل شده است و TTTT به عنوان فاصله دهنده در وسط استفاده می شود.

پرایمرهای بیرونی F3 و B3 به ترتیب از نواحی F3 و B3 روی ژن هدف تشکیل شده اند.

در سیستم واکنش LAMP، غلظت پرایمر داخلی چندین برابر پرایمر خارجی است.آغازگر داخلی ابتدا با رشته الگو ترکیب می شود تا یک رشته مکمل برای تشکیل یک رشته DNA دوتایی ساخته شود.متعاقباً، پرایمر بیرونی با رشته الگو ترکیب می شود تا یک رشته دوتایی DNA تشکیل شود.تحت تاثیر BstDNA پلیمراز، رشته مکمل سنتز شده توسط پرایمر داخلی آزاد می شود.پس از یک سری واکنش، رشته مکمل در نهایت یک رشته DNA با ساختار دمبلی را تشکیل می دهد.

تک رشته DNA ساختار دمبل خود به عنوان یک الگو برای تشکیل پیوسته DNA ساختار حلقه ساقه انتقالی با انتهای باز استفاده می شود.آغازگرهای داخلی و خارجی DNA ساختار حلقه ساقه انتقالی را هدایت می کنند تا به طور مداوم تحت واکنش های جابجایی و گسترش رشته قرار گیرد و در نهایت ساختارهای حلقه ساقه-حلقه ای با طول های مختلف را تشکیل دهند.مخلوط DNA

مزایا و معایب تقویت همدما با واسطه حلقه

مزایای لامپ:

(1) راندمان تقویت بالا، که می تواند به طور موثر 1-10 نسخه از ژن هدف را در عرض 1 ساعت تکثیر کند و راندمان تقویت 10-100 برابر PCR معمولی است.

(2) زمان واکنش کوتاه است، ویژگی قوی است و تجهیزات خاصی مورد نیاز نیست.

کاستی های LAMP:

(1) الزامات برای پرایمرها به ویژه زیاد است.

(2) محصول تقویت شده را نمی توان برای شبیه سازی و توالی یابی استفاده کرد، بلکه فقط می تواند برای قضاوت استفاده شود.

(3) با توجه به حساسیت قوی آن، تشکیل ذرات معلق در هوا آسان است، که باعث مثبت کاذب می شود و بر نتایج آزمایش تأثیر می گذارد.

Sتقویت جابجایی ترند

تقویت جابجایی رشته (SDA) یک تکنیک تقویت DNA همدما در شرایط آزمایشگاهی مبتنی بر واکنش آنزیمی است که برای اولین بار توسط محقق آمریکایی واکر در سال 1992 ارائه شد.

سیستم پایه SDA شامل یک اندونوکلئاز محدود، یک DNA پلیمراز با فعالیت جابجایی رشته، دو جفت پرایمر، dNTPs و یون های کلسیم و منیزیم و سیستم های بافر است.

اصل تقویت جابجایی رشته بر اساس توالی تشخیص اندونوکلئاز محدود اصلاح شده شیمیایی در هر دو انتهای DNA هدف است.اندونوکلئاز شکاف در DNA رشته را در محل تشخیص آن باز می کند و DNA پلیمراز شکاف 3' End را گسترش می دهد و رشته DNA بعدی را جایگزین می کند.

تک رشته های جایگزین شده DNA را می توان با پرایمرها ترکیب کرد و توسط DNA پلیمراز به رشته های دوتایی گسترش داد.این فرآیند به طور مداوم تکرار می شود، به طوری که دنباله هدف به طور موثر تقویت می شود.

مزایا و معایب تکنولوژی تقویت جابجایی رشته

مزایای SDA:

راندمان تقویت بالا است، زمان واکنش کوتاه است، ویژگی قوی است و به تجهیزات خاصی نیاز نیست.

کاستی های SDA:

محصولات یکنواخت نیستند و برخی از محصولات تک رشته ای و دو رشته ای همیشه در چرخه SDA تولید می شوند و در صورت تشخیص با الکتروفورز، باطله شدن ناگزیر رخ می دهد.

Rتقویت دایره olling

تقویت دایره غلتشی (RCA) با استفاده از روش کپی کردن DNA از ارگانیسم های بیماری زا توسط دایره غلتشی پیشنهاد می شود.به استفاده از DNA دایره ای تک رشته ای به عنوان یک الگو در دمای ثابت و یک DNA پلیمراز ویژه (مانند Phi29) تحت عمل سنتز DNA دایره چرخشی برای دستیابی به تقویت ژن هدف اشاره دارد.

RCA را می توان به تقویت خطی و تقویت نمایی تقسیم کرد.بازده RCA خطی می تواند به 10 برسد⁵بار، و بازده RCA نمایی می تواند به 10 برسد⁹بار.

تمایز ساده، همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است، تقویت خطی a فقط از 1 آغازگر استفاده می کند، تقویت نمایی b دارای 2 پرایمر است.

RCA خطی RCA تک پرایمر نیز نامیده می شود.پرایمر به DNA دایره ای متصل می شود و با عمل DNA پلیمراز گسترش می یابد.محصول یک رشته منفرد خطی با تعداد زیادی توالی تکراری هزاران برابر طول یک حلقه است.

از آنجایی که محصول RCA خطی همیشه به پرایمر شروع کننده متصل است، تثبیت آسان سیگنال یک مزیت عمده است.

RCA نمایی، همچنین به عنوان تقویت بیش از حد شاخه ای HRCA (Hyper branched RCA)، در RCA نمایی، یک آغازگر محصول RCA را تقویت می کند، پرایمر دوم با محصول RCA هیبرید می شود و گسترش می یابد، و جایگزینی از قبل به محصول RCA متصل شده است. پرایمرهای پایین دست رشته را گسترش می دهند، و یک محصول اکستنشن و جایگزینی RCA را تکرار می کنند.

مزایا و معایب تقویت اسید نوکلئیک دایره نورد

مزایای RCA:

حساسیت بالا، ویژگی خوب و عملکرد آسان.

کاستی های RCA:

مشکلات پس زمینه در هنگام تشخیص سیگنالدر طی واکنش RCA، کاوشگر قفل بدون گردش و DNA یا RNA الگوی پروب بی‌پیوند ممکن است برخی سیگنال‌های پس‌زمینه تولید کنند. 

Nتقویت مبتنی بر توالی ucleicacid

تقویت مبتنی بر توالی اسید نوکلئیک (NASBA) یک فناوری جدید است که بر اساس PCR توسعه یافته است.این یک تقویت مداوم و همدما اسید نوکلئیک است که توسط یک جفت پرایمر با یک توالی پروموتر T7 هدایت می شود.این فناوری می تواند RNA الگو را در حدود 2 ساعت حدود 109 برابر تقویت کند که 1000 برابر بیشتر از روش PCR معمولی است و به تجهیزات خاصی نیاز ندارد.

این فناوری برای تشخیص سریع بیماری ها به محض ظهور مورد استفاده قرار گرفته است و در حال حاضر بسیاری از شرکت ها از این روش در کیت های تشخیص RNA استفاده می کنند.

اگرچه تقویت RNA می تواند از فناوری PCR رونویسی معکوس نیز استفاده کند، NASBA مزایای خاص خود را دارد: می توان آن را در شرایط دمایی نسبتاً ثابت انجام داد و نسبت به فناوری PCR سنتی پایدارتر و دقیق تر است.

واکنش در دمای 41 درجه سانتیگراد است و برای تکمیل به AMV (ویروس میلوبلاستوز پرندگان) رونوشت معکوس، RNase H، T7 RNA پلیمراز و یک جفت پرایمر نیاز دارد.

فرآیند به طور عمده شامل:

پرایمر فوروارد حاوی توالی مکمل پروموتر T7 است.در طی واکنش، پرایمر فوروارد به رشته RNA متصل می شود و توسط آنزیم AMV کاتالیز می شود تا یک رشته دو رشته DNA-RNA را تشکیل دهد.

RNase H RNA موجود در دو رشته هیبریدی را هضم می کند و DNA تک رشته ای را حفظ می کند.

تحت عمل پرایمر معکوس و آنزیم AMV، یک رشته دو رشته DNA حاوی توالی پروموتر T7 تشکیل می شود.

تحت تأثیر RNA پلیمراز T7، فرآیند رونویسی کامل شده و مقدار زیادی RNA هدف تولید می شود.

مزایای NASBA:

(1) پرایمر آن دارای یک توالی پروموتر T7 است، اما DNA دو رشته ای خارجی دارای توالی پروموتر T7 نیست و نمی توان آن را تقویت کرد، بنابراین این فناوری دارای ویژگی و حساسیت بالایی است.

(2) NASBA مستقیماً فرآیند رونویسی معکوس را در واکنش تقویت می‌کند و زمان واکنش را کوتاه می‌کند.

معایب NASBA:

(1) اجزای واکنش پیچیده تر هستند.

(2) سه نوع آنزیم برای افزایش هزینه واکنش مورد نیاز است.