PCR, چندگانه PCR, PCR درجا, PCR معکوس, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

ما مفاهیم، ​​مراحل و جزئیات مختلف PCR را مرتب خواهیم کرد

Ⅰ. PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز که به آن PCR می گویند، یک فناوری بیولوژیکی مولکولی است که برای بزرگ کردن قطعات DNA خاص استفاده می شود.می توان آن را به عنوان یک تکثیر DNA ویژه در شرایط آزمایشگاهی در نظر گرفت.DNA پلیمراز (DNA Polymerase I) در اوایل سال 1955 کشف شد، و قطعه کلنو از E. Coli که دارای ارزش تجربی و کاربردی است، توسط دکتر H. Klenow در اوایل دهه 1970 کشف شد، اما از آنجا که این آنزیم دما را تحمل نمی کند، دمای بالا می تواند آن را تخریب کند، بنابراین با واکنش درجه حرارت پلیمراز تجزیه نمی شود.آنزیم های مورد استفاده امروزه (به نام Taq polymerase)، از Thermus aquaticus، یک باکتری چشمه آب گرم در سال 1976 جدا شد. ویژگی آن این است که می تواند در برابر دمای بالا مقاومت کند و یک آنزیم ایده آل است، اما پس از دهه 1980 به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفت.مفهوم اولیه نمونه اولیه اولیه PCR شبیه به ترمیم و کپی ژن است که توسط دکتر KJell Kleppe در سال 1971 پیشنهاد شد. او اولین نسخه ساده و کوتاه مدت ژن را منتشر کرد (مشابه واکنش های دو چرخه اول PCR).PCR توسعه یافته امروز توسط دکتر Kary B. Mullis در سال 1983 توسعه یافت. دکتر Mullis در آن سال به شرکت های PE خدمت کرد، بنابراین PE جایگاه ویژه ای در صنعت PCR دارد.دکتر Mullis اولین مقاله مرتبط با Saiki و دیگران را در سال 1985 به طور رسمی منتشر کرد. از آن زمان استفاده از PCR هزاران مایل در روز است و می توان گفت کیفیت مقالات مرتبط بسیاری از روش های تحقیقاتی دیگر را ناخوشایند می کند.متعاقباً، فناوری PCR به طور گسترده در تحقیقات علمی بیولوژیکی و کاربردهای بالینی مورد استفاده قرار می گیرد و به مهم ترین فناوری تحقیقات زیست شناسی مولکولی تبدیل می شود.مولیس در سال 1993 برنده جایزه نوبل شیمی نیز شد.

PCRاصل

اصل اساسی فناوری PCR مشابه فرآیند تکثیر طبیعی DNA است و ویژگی آن به پرایمر الیگونوکلئوتیدی که مکمل هر دو انتهای توالی هدف است بستگی دارد.PCR از انحطاط - بازپخت - گسترش سه مرحله واکنش اصلی تشکیل شده است: ① انحطاط DNA الگو: پس از اینکه DNA الگو تا حدود 93 درجه سانتیگراد برای مدت زمان معینی گرم شد، محلول DNA دوگانه برای DNA زنجیره دوگانه تشکیل شده توسط PCR تکثیر DNA الگو، آن را به صورت یک زنجیره منفرد برای ترکیب شدن با زنجیره بعدی آماده کنید.②بازپخت (ترکیب) DNA الگو و پرایمر: پس از گرم شدن DNA الگو و تبدیل آن به یک زنجیره واحد، دما تا حدود 55 درجه سانتیگراد کاهش می یابد.توالی مکمل پرایمر و الگوی DNA تک زنجیره ای.③ گسترش پرایمر: الگوی DNA- اتصال پرایمر بر اساس عمل TaqDNA پلیمراز، با dNTP به عنوان ماده خام واکنش است.اصل تکثیر را حفظ کنید، یک زنجیره کپی نیمه رزرو شده جدید سنتز کنید که زنجیره DNA الگو را تکمیل می کند، و تکرار چرخه انحطاط - بازپخت - گسترش سه فرآیند می تواند "زنجیره کپی نیمه رزرو شده" بیشتری دریافت کند، و این زنجیره جدید دوباره در دسترس است و به یک الگو برای چرخه بعدی تبدیل شوید.2-4 دقیقه طول می کشد تا حلقه کامل شود، ژن هدف را می توان چندین میلیون بار در 2-3 ساعت تقویت کرد.

استانداردPCRسیستم واکنش

پنج عنصر واکنش PCR

عمدتاً پنج نوع ماده در واکنش PCR وجود دارد که عبارتند از پرایمر، آنزیم، dNTP، قالب و بافر (Mg2+ مورد نیاز است).[روش PCR]

فرآیند استاندارد PCR به سه مرحله تقسیم می شود

1. انحطاط DNA (90 درجه سانتیگراد تا 96 درجه سانتیگراد): الگوهای DNA دو زنجیره ای تحت عمل حرارتی، پیوندهای هیدروژنی شکسته شده و DNA تک زنجیره ای را تشکیل می دهند.

2. بازپخت (25 ℃ -65 ℃): دمای سیستم کاهش می یابد، پرایمر با الگوی DNA ترکیب می شود تا یک زنجیره دوگانه محلی را تشکیل دهد.

3. پسوند (70 ℃ -75 ℃): تحت عمل آنزیم Taq (حدود 72 درجه سانتی گراد، بهترین فعالیت)، dNTP به عنوان ماده خام استفاده می شود، از انتهای 5 پرایمر → انتهای 3' گسترش می یابد، سنتز و الگو مکمل زنجیره DNA یکدیگر هستند.

هر چرخه دناتوره، بازپخت و گسترش می یابد و محتوای DNA را دو برابر می کند.در حال حاضر به دلیل کوتاه بودن ناحیه تقویت، می توان مقداری PCR را در زمان بسیار کوتاهی تکرار کرد، حتی اگر فعالیت آنزیم Taq بهینه نباشد، بنابراین می توان آن را به دو مرحله تغییر داد، یعنی بازپخت و اکستنشن را می توان همزمان در دمای 60-65 درجه سانتی گراد انجام داد.به منظور کاهش فرآیند بلند کردن و خنک کردن و بهبود سرعت پاسخ.

ویژگی های واکنش PCR

● ویژگی بالا

عوامل تعیین کننده خاص پاسخ PCR عبارتند از: ①ترکیب خاص پرایمر و DNA الگو.②اصل جفت شدن پایه.③ وفاداری به واکنش سنتز TaqDNA پلیمراز.④ویژگی و محافظه کاری ژن هدف.

ترکیب صحیح پرایمرها و الگوها کلید اصلی این کار است.اتصال پرایمر و قالب و گسترش زنجیره پرایمر بر اساس اصل تطبیق پایه قلیایی است.وفاداری واکنش های سنتز پلیمراز و مقاومت دمایی بالای Taq DNA پلیمراز برای ایجاد اتصال (ترکیب) الگو و آغازگر در واکنش را می توان در دمای بالاتر انجام داد.ویژگی این ترکیب بسیار افزایش یافته است.این کلیپ می تواند درجه بالایی از صحت را حفظ کند.با انتخاب یک منطقه ژنتیکی هدف با محافظه کاری بالا و محافظه کاری بالا، ویژگی آن بیشتر می شود.

● حساسیت بالا

حجم تولید محصولات PCR با شاخص افزایش می یابد که می تواند الگوی شروع Picker (PG=10-12) را برای افزایش سطح میکروکنترلر تا سطح میکروگرم (μg= -6) گسترش دهد.یک سلول هدف را می توان از 1 میلیون سلول تشخیص داد.در تشخیص ویروس ها، حساسیت PCR می تواند به 3 RFU برسد (واحدهای ایجاد شده در نقاط خالی).حداقل میزان تشخیص در علم باکتری 3 باکتری است.

● ساده و سریع

انعکاس PCR از یک Taq DNA پلیمراز با دمای بالا استفاده می‌کند که محلول واکنش را در یک زمان اضافه می‌کند، یعنی یک واکنش انحطاط - آنیل - گسترش روی محلول تقویت DNA و گلدان حمام آب.به طور کلی، واکنش تقویت در 2 تا 4 ساعت کامل می شود.محصولات افزوده شده به طور کلی توسط شمشیر الکتریکی آنالیز می شوند و نیازی به استفاده از ایزوتوپ، عدم آلودگی رادیواکتیو و تبلیغ آسان ندارند.

● خلوص نمونه کم است

نیازی به جداسازی ویروس ها یا باکتری ها و سلول های کشت نیست.محصولات خام DNA و RNA را می توان به عنوان تقویت کننده استفاده کرد.تشخیص تکثیر DNA را می توان مستقیما با استفاده از نمونه های بالینی مانند خون، مایع بدن، مایع شستشوی سرفه، مو، سلول ها و بافت زنده استفاده کرد.

PCRمشکلات رایج

● منفی کاذب، بدون باندهای تقویت شده

مراحل کلیدی واکنش PCR عبارتند از: ① تهیه اسیدهای نوکلئیک الگو، ② کیفیت و ویژگی پرایمرها، ③ کیفیت آنزیم ها ④ شرایط چرخه PCR.علت یابی نیز باید برای لینک های فوق مورد تحلیل و بررسی قرار گیرد.

الگوها: ① الگو حاوی پروتئین متفرقه است، ② الگو حاوی یک مهار کننده آنزیم Taq است، ③ پروتئین موجود در الگو حذف نمی شود، به خصوص پروتئین گروه در کروموزوم.⑤ تخریب اسید نوکلئیک مینر کامل نیست.وقتی کیفیت آنزیم ها و پرایمرها خوب باشد، نوار تقویتی وجود ندارد که به احتمال زیاد درمان گوارشی نمونه ها است.در فرآیند استخراج اسید نوکلئیک الگو اشکالی وجود دارد، بنابراین برای تهیه یک محلول هضم مؤثر و پایدار، باید روش آن ثابت شود و خودسرانه تغییر نکند.

غیرفعال سازی آنزیم: یک آنزیم جدید یا هر دو آنزیم قدیمی و جدید باید با هم استفاده شود تا بررسی شود که آیا فعالیت آنزیم از بین رفته یا کافی نیست و منجر به منفی کاذب می شود.لازم به ذکر است که گاهی اوقات آنزیم Taq یا اتیدیوم بروماید فراموش می شود.

پرایمر: کیفیت پرایمر، غلظت پرایمر و اینکه آیا غلظت دو پرایمر متقارن است یا خیر.این یک دلیل رایج برای شکست PCR است یا افزایش باند ایده آل و مستعد انتشار نیست.مشکلاتی در کیفیت پرایمرهای برخی از شماره های دسته ای وجود دارد.دو پرایمر دارای غلظت بالا و غلظت کم هستند که باعث تقویت نامتقارن با راندمان پایین می شوند.اقدامات متقابل عبارتند از: ① یک آغازگر خوب برای سنتز واحدها انتخاب کنید.② غلظت پرایمر نه تنها به مقدار OD بستگی دارد، بلکه به مایع اصلی پرایمر نیز برای ساخت الکتروفورز ژل قند آگار توجه می کند.باید یک ناحیه نوار پرایمر وجود داشته باشد و روشنایی دو پرایمر باید به طور کلی ثابت باشد.تسمه، PCR ممکن است در این زمان ناموفق باشد و باید با واحد سنتز پرایمر برطرف شود.اگر پرایمر زیاد باشد، روشنایی آن کم است و غلظت آن هنگام رقیق شدن باید متعادل باشد.③ پرایمر باید پرداخت شود و در غلظت بالا نگهداری شود تا از انجماد چندگانه یا سرد شدن طولانی مدت قطعات یخچال جلوگیری شود که باعث خراب شدن و تخریب پرایمر می شود.④ طراحی پرایمر نامعقول است، مانند طول پرایمر کافی نیست و خوشه دو بین آغازگرها تشکیل می شود.

غلظت Mg2+: غلظت یون Mg2+ تأثیر زیادی بر راندمان تقویت PCR دارد.غلظت بیش از حد می تواند جنس مخالف تقویت PCR را کاهش دهد.اگر غلظت خیلی کم باشد، خروجی تقویت PCR حتی باعث می شود که تقویت PCR بدون باند انبساط شکست بخورد.

تغییر حجم واکنش: حجم مورد استفاده در تقویت PCR 20ul، 30ul، و 50ul یا 100uL است، حجم زیاد کاربرد برای تقویت PCR با توجه به اهداف مختلف تحقیقات علمی و آزمایش های بالینی تنظیم می شود.پس از ساخت حجم های کوچک مانند 20ul باید در هنگام ساخت سایز حالت بند ناف ایجاد شود در غیر این صورت از کار می افتد.

دلایل فیزیکی: تبدیل برای تقویت PCR بسیار مهم است.اگر دمای انحطاط کم باشد، زمان انحطاط کوتاه است، احتمالاً در منفی کاذب رخ می دهد.دمای بازپخت بسیار پایین می تواند باعث تقویت غیر اختصاصی شود و بازده تقویت ویژه را کاهش دهد.ترکیب پرایمرها و قالب ها برای کاهش راندمان تقویت PCR بسیار موثر است.گاهی اوقات لازم است از دماسنج های استاندارد برای تشخیص تغییرپذیری، بازپخت و افزایش دما در اجاق گاز محلول در آب استفاده شود که یکی از دلایل شکست PCR است.

واریانتهای توالی هدف: اگر توالی هدف رخ دهد، جهش یا حذف شود، ترکیب نمونه اولیه و الگو با هم ترکیب شود یا به دلیل نبود توالی هدف، پرایمر و الگو توالی مکمل را از دست می دهند و تکثیر PCR آن موفقیت آمیز نخواهد بود.

● مثبت کاذب

باند تقویت PCR مطابق با باند توالی هدف به نظر می رسد و گاهی اوقات باند آن مرتب تر و بالاتر است.

طراحی پرایمر مناسب نیست: توالی تقویت انتخاب شده و توالی تقویت غیر هدف همولوگ هستند، بنابراین هنگام تقویت PCR، محصولات PCR تقویت شده توالی غیر هدفمند هستند.دنباله هدف خیلی کوتاه است یا پرایمر خیلی کوتاه است و مستعد مثبت کاذب است.نیاز به طراحی مجدد

آلودگی متقاطع توالی هدف یا محصولات تقویتی: دو دلیل برای این آلودگی وجود دارد: اول، آلودگی متقاطع کل ژنوم یا بخش های بزرگ، که منجر به مثبت کاذب می شود.این نوع مثبت کاذب را می توان با روش های زیر حل کرد: در حین کار مراقب و ملایم باشید تا از استنشاق توالی هدف به تفنگ نمونه یا پاشش به بیرون از لوله گریز از مرکز جلوگیری کنید.به جز آنزیم ها و موادی که نمی توانند در برابر دمای بالا مقاومت کنند، تمام معرف ها یا تجهیزات باید با فشار بالا ضد عفونی شوند.لوله های گریز از مرکز و نمونه ها باید در یک زمان استفاده شوند.در صورت لزوم، قبل از افزودن نمونه ها، لوله واکنش و معرف در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار می گیرند تا اسید نوکلئیک موجود را از بین ببرد.دوم، قطعات کوچک در آلودگی هوا.این قطعات کوچک کوتاهتر از دنباله هدف هستند، اما همسانی خاصی دارند.می توان آن را با یکدیگر متصل کرد.پس از تکمیل پرایمرها می توان محصول PCR را منبسط کرد که باعث تولید مثبت کاذب می شود.می توان از آن برای کاهش یا حذف روش Nest PCR استفاده کرد.

● باند تقویت غیر اختصاصی ظاهر شود

باندهایی که پس از تقویت PCR ظاهر می شوند با اندازه مورد انتظار، یا بزرگ یا کوچک، یا همزمان، یا در همان زمان، باندهای تقویت خاص و باندهای تقویت غیر اختصاصی ناسازگار هستند.ظهور باندهای غیر اختصاصی به این صورت است: اول اینکه پرایمرها مکمل توالی هدف ناقص هستند یا پلیمریزاسیون پرایمر برای تشکیل یک خوشه دو.دوم اینکه غلظت یون های MG2+ خیلی زیاد است، دمای بازپخت خیلی کم است و تعداد چرخه های PCR مرتبط است.ثانیاً کیفیت و میزان آنزیم ها.اغلب، آنزیم های برخی از منابع مستعد نوارهای غیر خاص هستند و آنزیم های منبع دیگر وجود ندارند.گاهی اوقات تقویت غیر اختصاصی آنزیم ها نیز رخ می دهد.اقدامات متقابل عبارتند از: در صورت لزوم، جذابیت ها را دوباره طراحی کنید.مقدار آنزیم را کاهش دهید یا آنزیم منبع دیگری را جایگزین کنید.مقدار اولیه را کاهش دهید، مقدار الگوها را به طور مناسب افزایش دهید و تعداد چرخه ها را کاهش دهید.دمای بازپخت را به درستی افزایش دهید یا از روش دو نقطه دمایی (93 درجه سانتیگراد انحطاط، بازپخت و گسترش در حدود 65 درجه سانتیگراد) استفاده کنید.

● یدک کش یا نوار لکه دار ظاهر شود

گاهی اوقات به نظر می رسد که تقویت PCR به صورت پوسته ای یا تسمه فرش مانند اعمال می شود.به همین دلیل، به دلیل مقدار بیش از حد آنزیم ها یا کیفیت پایین آنزیم، غلظت dNTP خیلی زیاد، غلظت Mg2+ خیلی زیاد، دمای بازپخت خیلی کم و تعداد چرخه ها خیلی زیاد است.اقدامات متقابل عبارتند از: ①کاهش مقدار آنزیم ها یا تغییر آنزیم منبع دیگری.②کاهش غلظت dNTP ③به درستی غلظت Mg2+ را کاهش دهید.④تعداد قالب ها را افزایش دهید و تعداد چرخه ها را کاهش دهید.

محصولات مرتبط

PCR Heroᴹ (با رنگ)

◮ وفاداری بالاتر: 6 برابر آنزیم Taq معمولی.

◮ سرعت تقویت بیشتر

◮ سازگاری بیشتر با قالب

◮ راندمان تقویت بالاتر

◮ تحمل محیطی قوی تر است: در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک هفته قرار می گیرد و بیش از 90٪ فعالیت را حفظ می کند.

◮ دارای فعالیت DNA پلیمراز 5'→3' و فعالیت اگزونوکلئاز 5'→3'، بدون فعالیت اگزونوکلئاز 3'→5' است.

PCR Easyᵀᴹ (با رنگ)

سیستم واکنش منحصر به فرد و Taq DNA پلیمراز با راندمان بالا باعث می شود واکنش PCR دارای راندمان تقویت، ویژگی و حساسیت بالاتری باشد.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (یک مرحله ای) - SYBR Green I

◮ کیت یک مرحله ای رونویسی معکوس و qPCR را دو واکنش در یک لوله انجام می دهد، فقط باید RNA الگو، پرایمرهای خاص PCR و ddH بدون RNase اضافه شود.₂O.

◮ کیت می تواند به سرعت و به طور کارآمد RNA ویروسی یا RNA ردیابی را تجزیه و تحلیل کند.

◮ این کیت از یک معرف رونویسی معکوس منحصر به فرد Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase همراه با یک سیستم واکنش منحصر به فرد برای بهبود موثر بازده تقویت و ویژگی واکنش استفاده می کند.

◮ سیستم واکنش بهینه شده باعث می شود واکنش حساسیت تشخیص بالاتر، پایداری حرارتی قوی تر و تحمل بهتری داشته باشد.

◮ RT-qPCR آسان^TM(یک مرحله) - کیت SYBR Green I همراه با رنگ مرجع داخلی ROX است که می تواند برای حذف پس زمینه سیگنال و خطاهای سیگنال بین چاه ها استفاده شود که برای مشتریان مناسب است تا در مدل های مختلف ابزارهای PCR کمی استفاده کنند.

RT آسان^TMII (مستر پیش میکس برای سنتز cDNA رشته اول برایReal Time PCR)

-توانایی کارآمد برای حذف gDNA، که می تواند gDNA را در قالب در عرض 2 دقیقه حذف کند.

-سیستم رونویسی معکوس کارآمد، تنها 15 دقیقه طول می کشد تا سنتز اولین رشته cDNA کامل شود.

-قالب های پیچیده: قالب هایی با محتوای GC بالا و ساختار ثانویه پیچیده نیز می توانند با کارایی بالا معکوس شوند.

-سیستم رونویسی معکوس با حساسیت بالا، الگوهای سطح pg نیز می توانند cDNA با کیفیت بالا دریافت کنند.

-سیستم رونویسی معکوس پایداری حرارتی بالایی دارد، دمای واکنش بهینه 42 درجه سانتیگراد است و هنوز هم عملکرد رونویسی معکوس خوبی در 50 درجه سانتیگراد دارد.