PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یکی از فناوری های تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی است که بیش از 30 سال سابقه دارد.

فن آوری PCR توسط Kary Mullis از Cetus، ایالات متحده در سال 1983 پیشگام شد. Mullis در سال 1985 برای ثبت اختراع PCR درخواست داد و اولین مقاله دانشگاهی PCR در مورد Science را در همان سال منتشر کرد.مولیس در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را برای کارهایش دریافت کرد.

اصول اولیه PCR

PCR می تواند قطعات DNA هدف را بیش از یک میلیون بار تقویت کند.اصل تحت کاتالیز DNA پلیمراز، با استفاده از DNA رشته مادر به عنوان الگو و آغازگر خاص به عنوان نقطه شروع گسترش است.در شرایط آزمایشگاهی از طریق مراحلی مانند دناتوراسیون، بازپخت و گسترش تکرار می شود.فرآیند DNA رشته دختر مکمل DNA الگوی رشته مادر.

فرآیند استاندارد PCR به سه مرحله تقسیم می شود:

1. Denaturation: از دمای بالا برای جداسازی رشته های دوتایی DNA استفاده کنید.پیوند هیدروژنی بین رشته های دوگانه DNA در دمای بالا (93-98 درجه سانتیگراد) شکسته می شود.

2. بازپخت: پس از جدا شدن DNA دو رشته ای، دما را کاهش دهید تا پرایمر بتواند به DNA تک رشته ای متصل شود.

3. گسترش: DNA پلیمراز شروع به سنتز رشته های مکمل در امتداد رشته های DNA از آغازگرهای متصل با کاهش دما می کند.هنگامی که گسترش کامل شد، یک چرخه کامل می شود و تعداد قطعات DNA دو برابر می شود

با برگشت این سه مرحله 25-35 بار، تعداد قطعات DNA به طور تصاعدی افزایش می یابد.

خلاقیت PCR در این است که می توان پرایمرهای مختلفی را برای ژن های هدف مختلف طراحی کرد، به طوری که قطعات ژن هدف را می توان در مدت زمان کوتاهی تکثیر کرد.

تاکنون PCR را می توان به سه دسته PCR معمولی، PCR کمی فلورسنت و PCR دیجیتال تقسیم کرد.

نسل اول PCR معمولی

از یک ابزار معمولی تقویت PCR برای تکثیر ژن مورد نظر استفاده کنید و سپس از الکتروفورز ژل آگارز برای تشخیص محصول استفاده کنید، فقط می توان آنالیز کیفی را انجام داد.

معایب اصلی PCR نسل اول:

1. مستعد تقویت غیر اختصاصی و نتایج مثبت کاذب.

2. تشخیص زمان زیادی طول می کشد و عملیات دست و پا گیر است.

3. فقط آزمون کیفی می تواند انجام شود

نسل دوم Real-Time PCR

Real-Time PCR که به عنوان qPCR نیز شناخته می شود، از پروب های فلورسنت استفاده می کند که می تواند پیشرفت سیستم واکنش را نشان دهد و انباشت محصولات تقویت شده را از طریق تجمع سیگنال های فلورسنت نظارت می کند و نتایج را از طریق منحنی فلورسانس قضاوت می کند.می توان آن را با کمک مقدار Cq و منحنی استاندارد کمی سازی کرد.

از آنجایی که فناوری qPCR در یک سیستم بسته انجام می‌شود، احتمال آلودگی کاهش می‌یابد و سیگنال فلورسانس می‌تواند برای تشخیص کمی نظارت شود، بنابراین بیشترین استفاده در عمل بالینی است و به فناوری غالب در PCR تبدیل شده است.

مواد فلورسنت مورد استفاده در PCR کمی فلورسنت زمان واقعی را می توان به موارد زیر تقسیم کرد: پروب فلورسنت TaqMan، چراغ های مولکولی و رنگ فلورسنت.

1) پروب فلورسنت TaqMan:

در طول تقویت PCR، یک پروب فلورسنت خاص در حالی که یک جفت پرایمر اضافه می شود، اضافه می شود.پروب یک الیگونوکلئوتید است و هر دو انتهای آن با یک گروه فلورسنت گزارشگر و یک گروه فلورسنت خاموش کننده برچسب گذاری شده است.

هنگامی که پروب دست نخورده است، سیگنال فلورسنت ساطع شده توسط گروه گزارشگر توسط گروه خاموش کننده جذب می شود.در طی تقویت PCR، فعالیت اگزونوکلئاز 5'-3' آنزیم Taq، پروب را می شکافد و تجزیه می کند، و گروه فلورسنت گزارشگر را خاموش می کند. سیگنال فلورسانس به طور کامل با تشکیل محصول PCR هماهنگ است.

2) رنگ فلورسنت SYBR:

در سیستم واکنش PCR، مقدار اضافی رنگ فلورسنت SYBR اضافه می شود.پس از اینکه رنگ فلورسنت SYBR به طور غیر اختصاصی در DNA دو رشته ای گنجانده شد، یک سیگنال فلورسنت منتشر می کند.مولکول رنگ SYBR که در زنجیره گنجانده نشده است هیچ سیگنال فلورسنتی منتشر نمی کند، در نتیجه سیگنال فلورسنت افزایش محصولات PCR کاملاً با افزایش محصولات PCR هماهنگ است.SYBR فقط به DNA دو رشته ای متصل می شود، بنابراین منحنی ذوب را می توان برای تعیین اینکه آیا واکنش PCR خاص است استفاده کرد.

3) چراغ مولکولی:

این یک کاوشگر الیگونوکلئوتیدی دارای دو نشاندار با حلقه ساقه است که ساختار سنجاق موی حدوداً 8 پایه را در انتهای 5 و 3 تشکیل می دهد.توالی‌های اسید نوکلئیک در هر دو انتها به طور مکمل جفت می‌شوند و باعث می‌شوند که گروه فلورسنت و گروه کوئنچ محکم شوند.بستن، هیچ فلورسانس تولید نخواهد شد.

پس از تولید محصول PCR، در طی فرآیند بازپخت، قسمت میانی فانوس مولکولی با یک توالی DNA خاص جفت می‌شود و ژن فلورسنت از ژن quencher جدا می‌شود تا فلورسانس تولید کند.

معایب اصلی PCR نسل دوم:

حساسیت هنوز وجود ندارد و تشخیص نمونه های کم کپی دقیق نیست.

تأثیر مقدار پس‌زمینه وجود دارد و نتیجه مستعد تداخل است.

هنگامی که مهارکننده های PCR در سیستم واکنش وجود دارد، نتایج تشخیص مستعد تداخل هستند.

نسل سوم دیجیتال PCR

PCR دیجیتال (DigitalPCR، dPCR، Dig-PCR) تعداد کپی توالی هدف را از طریق تشخیص نقطه پایانی محاسبه می کند و می تواند بدون استفاده از کنترل های داخلی و منحنی های استاندارد، تشخیص کمی مطلق را انجام دهد.

PCR دیجیتال از تشخیص نقطه پایانی استفاده می کند و به مقدار Ct (آستانه چرخه) بستگی ندارد، بنابراین واکنش دیجیتال PCR کمتر تحت تأثیر راندمان تقویت قرار می گیرد و تحمل به مهارکننده های واکنش PCR با دقت و تکرارپذیری بالا بهبود می یابد.

با توجه به ویژگی های حساسیت بالا و دقت بالا، به راحتی توسط مهار کننده های واکنش PCR تداخل پیدا نمی کند و می تواند به کمیت مطلق واقعی بدون محصولات استاندارد که تبدیل به یک کانون تحقیقاتی و کاربردی شده است، دست یابد.

با توجه به اشکال مختلف واحد واکنش، می توان آن را به سه نوع اصلی تقسیم کرد: سیستم های میکروسیال، تراشه و قطره.

1) میکروفلوئیدیک دیجیتال PCR، mdPCR:

بر اساس فناوری میکروسیال، الگوی DNA جدا می شود.فناوری میکروسیال می‌تواند به‌روزرسانی نانو نمونه یا تولید قطرات کوچک‌تر را محقق کند، اما این قطرات به روش جذب خاصی نیاز دارند و سپس با سیستم واکنش PCR ترکیب می‌شوند.mdPCR به تدریج با روش های دیگر جایگزین شده است.

2) PCR دیجیتال مبتنی بر قطره، ddPCR:

از فناوری تولید قطرات آب در روغن برای پردازش نمونه به قطرات استفاده کنید و سیستم واکنش حاوی مولکول‌های اسید نوکلئیک را به هزاران قطره در مقیاس نانو تقسیم کنید، که هر کدام حاوی مولکول هدف اسید نوکلئیک نیستند که باید شناسایی شوند، یا حاوی یک تا چند مولکول هدف اسید نوکلئیک هستند که باید آزمایش شوند.

3) PCR دیجیتال مبتنی بر تراشه، cdPCR:

از فناوری مسیر سیال یکپارچه برای حکاکی بسیاری از ریزلوله ها و ریزحفره ها روی ویفرهای سیلیکونی یا شیشه کوارتز استفاده کنید و جریان محلول را از طریق دریچه های کنترل مختلف کنترل کنید و مایع نمونه را به نانومترهای هم اندازه در چاهک های واکنش برای واکنش دیجیتال PCR برای رسیدن به کمیت مطلق تقسیم کنید.

معایب اصلی PCR نسل سوم:

تجهیزات و معرف ها گران هستند.

الزامات کیفیت قالب بالا است.اگر مقدار الگو از کمیت میکروسیستم بیشتر شود، تعیین کمیت غیرممکن خواهد بود و اگر خیلی کم باشد، دقت کمی کاهش می یابد.

هنگامی که تقویت غیر اختصاصی وجود دارد، مثبت کاذب نیز می تواند ایجاد شود.