به عنوان یک گیاه جدید در آزمایشگاه، غربال کردن گیاهان مثبت از دسته ای از گیاهان با نرخ تبدیل پایین کار خوبی نیست.ابتدا باید DNA از تعداد زیادی نمونه یکی یکی استخراج شود و سپس ژن های خارجی توسط PCR شناسایی شوند.با این حال، نتایج اغلب خالی و نوارهایی با چند آیتم گهگاهی هستند، اما تعیین اینکه آیا تشخیص های از دست رفته یا تشخیص های اشتباه وجود دارد غیرممکن است..آیا مواجهه با چنین فرآیند و نتایج آزمایشی بسیار درمانده است؟نگران نباشید، برادر به شما یاد می دهد که چگونه گیاهان مثبت تراریخته را به راحتی و با دقت غربال کنید.

مرحله 1

آغازگرهای تشخیص طراحی

ژن درون زا و ژن اگزوژن را که باید با توجه به نمونه مورد آزمایش شناسایی شوند، تعیین کنید و یک توالی 100-500 جفت باز در ژن را برای طراحی پرایمر انتخاب کنید.پرایمرهای خوب می توانند از صحت نتایج تشخیص اطمینان حاصل کنند و زمان تشخیص را کوتاه کنند (پیوست را برای پرایمرهای تشخیصی که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند مراجعه کنید).

توجه: پرایمرهای جدید طراحی شده نیاز به بهینه سازی شرایط واکنش و تأیید صحت، دقت و حد تشخیص تشخیص قبل از تشخیص در مقیاس بزرگ دارند.

گام 2

طراحی پروتکل آزمایشی

کنترل مثبت: از DNA خالص حاوی قطعه هدف به عنوان یک الگو برای تعیین اینکه آیا سیستم واکنش PCR و شرایط نرمال است استفاده کنید.

کنترل منفی/خالی: برای تشخیص وجود منبع آلودگی در سیستم PCR از الگوی DNA یا ddH2O که حاوی قطعه هدف نیست به عنوان الگو استفاده کنید.

کنترل مرجع داخلی: از ترکیب پرایمر/کاوشگر ژن درون زا نمونه مورد آزمایش برای ارزیابی اینکه آیا الگو را می توان با PCR تشخیص داد، استفاده کنید.

اطلاع:

برای ارزیابی اعتبار نتایج تجربی، باید برای هر آزمون، کنترل های مثبت، منفی/خالی و کنترل های داخلی کنترل شود.

آماده سازی آزمایش

قبل از استفاده، بررسی کنید که آیا محلول به طور یکنواخت مخلوط شده است یا خیر.در صورت مشاهده بارش، باید قبل از استفاده، طبق دستورالعمل ها حل و مخلوط شود.مخلوط 2×PCR باید قبل از استفاده به صورت پیپت و با میکروپیپت مخلوط شود تا از توزیع ناهموار یون جلوگیری شود.

اطلاع:

دفترچه راهنما را بیرون بیاورید و آن را با دقت بخوانید و قبل از آزمایش مطابق با الزامات دفترچه راهنما آماده سازی کنید.

مرحله 4

سیستم واکنش PCR را آماده کنید

طبق پروتکل آزمایشی، پرایمرها، H2O و 2×PCR را به طور یکنواخت مخلوط کرده، سانتریفیوژ کرده و در هر لوله واکنش توزیع کنید.

اطلاع:

برای آزمایش در مقیاس بزرگ یا طولانی مدت، توصیه می شود از یک سیستم واکنش PCR حاوی آنزیم UNG استفاده کنید، که می تواند به طور موثر از آلودگی آئروسل ناشی از محصولات PCR جلوگیری کند.

مرحله 5

الگوی واکنش را اضافه کنید

با استفاده از فناوری Direct PCR، نیازی به فرآیند خسته کننده خالص سازی اسید نوکلئیک نیست، الگوی نمونه را می توان در عرض 10 دقیقه آماده کرد و سیستم واکنش PCR مربوطه را می توان اضافه کرد.

اطلاع:

روش برش اثر تشخیص بهتری دارد و محصول به دست آمده را می توان برای واکنش های تشخیص چندگانه استفاده کرد.

5.1: انبساط مستقیم برگها

با توجه به اندازه تصویر در دفترچه راهنما، بافت برگ را به قطر 2-3 میلی متر برش داده و در سیستم واکنش PCR قرار دهید.

توجه: مطمئن شوید که قطعات برگ به طور کامل در محلول واکنش PCR غوطه ور شده اند و بافت برگ را بیش از حد اضافه نکنید.

5.2: روش تقسیم برگ

بافت برگ را به قطر 5-7 میلی متر برش داده و در لوله سانتریفیوژ قرار دهید.اگر برگ های بالغ را انتخاب می کنید، لطفا از استفاده از بافت های رگبرگ اصلی برگ خودداری کنید.لیز 50 ul بافر P1 را در یک لوله سانتریفیوژ بریزید تا مطمئن شوید که لیز می تواند بافت برگ را به طور کامل غوطه ور کند، آن را در یک سیکلر حرارتی یا حمام فلزی قرار دهید و در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 تا 10 دقیقه لیز کنید.

50 لیتر محلول خنثی سازی بافر P2 را اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.لیزات به دست آمده را می توان به عنوان یک الگو استفاده کرد و به سیستم واکنش PCR اضافه کرد.

توجه: مقدار قالب بین 10-5 درصد سیستم PCR است و نباید از 20 درصد تجاوز کند (مثلاً در یک سیستم PCR 20 میکرولیتری، 1-2 میکرولیتر محلول لیز اضافه کنید، نه بیشتر از 4μl).

مرحله 6

واکنش PCR

پس از سانتریفیوژ کردن لوله واکنش PCR، برای تقویت در دستگاه PCR قرار می گیرد.

اطلاع:

در واکنش از الگوی غیر خالص برای تقویت استفاده می شود، بنابراین تعداد چرخه های تقویت 5-10 چرخه بیشتر از زمانی است که از الگوی DNA خالص استفاده می شود.

مرحله 7

تشخیص الکتروفورز و تجزیه و تحلیل نتیجه

M: 100bp DNA Ladder

1\4: روش DNA خالص

2\5: روش مستقیم PCR

3\6: کنترل خالی

QC:

نتایج آزمایش کنترل های مختلف تنظیم شده در آزمایش باید شرایط زیر را داشته باشد.در غیر این صورت باید علت مشکل را آنالیز کرد و پس از رفع مشکل دوباره آزمایش انجام داد.

جدول 1. نتایج آزمون نرمال گروه های کنترل مختلف

*وقتی پلاسمید به عنوان کنترل مثبت استفاده می شود، نتیجه آزمایش ژن درون زا می تواند منفی باشد

قضاوت نتیجه:

الف- نتیجه آزمایش ژن درون زا نمونه منفی است که نشان می دهد DNA مناسب برای تشخیص PCR معمولی را نمی توان از نمونه استخراج کرد یا DNA استخراج شده حاوی مهارکننده های واکنش PCR است و DNA باید دوباره استخراج شود.

ب- نتیجه آزمایش ژن درون زا نمونه مثبت و نتیجه آزمایش ژن اگزوژن منفی است که نشان می دهد DNA مناسب برای تشخیص معمولی PCR از نمونه استخراج شده است و می توان قضاوت کرد که ژن XXX در نمونه شناسایی نشده است.

ج- نتیجه آزمایش ژن درون زا نمونه مثبت و نتیجه آزمایش ژن اگزوژن مثبت است که نشان می دهد DNA مناسب برای تشخیص PCR معمولی از نمونه استخراج شده است و DNA نمونه حاوی ژن XXX است.آزمایش های تایید را می توان بیشتر انجام داد.

مرحله 8

آغازگرهای تشخیص طراحی

پس از انجام آزمایش، از محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد و محلول اتانول 70 درصد برای پاک کردن منطقه آزمایش برای جلوگیری از آلودگی محیط زیست استفاده کنید.