Ⅰ. افزایش حساسیت سیستم واکنش:

1. جداسازی RNA با کیفیت بالا:

سنتز موفق cDNA از RNA با کیفیت بالا ناشی می شود.RNA باکیفیت باید حداقل طول مدت طولانی‌تری را تضمین کند و حاوی بازدارنده‌هایی که حاوی آنزیم‌های ضبط کننده نیستند، مانند EDTA یا SDS نیست.کیفیت RNA حداکثر مقدار اطلاعات توالی را که می توانید به cDNA رونویسی کنید تعیین می کند.روش عمومی خالص سازی RNA یک روش مرحله ای برای استفاده از ایزوسیانات/اسیدوفنول است.به منظور جلوگیری از آلودگی RNase، RNA جدا شده از نمونه غنی از RNase (مانند پانکراس) به ذخیره سازی فرمالدئید نیاز دارد تا RNA با کیفیت بالا ذخیره شود، که حتی برای ذخیره سازی طولانی مدت بیشتر است.RNA استخراج شده از کبد موش اساساً پس از یک هفته نگهداری در آب تجزیه شد، در حالی که RNA استخراج شده از طحال موش پس از سه سال نگهداری در آب پایدار ماند.علاوه بر این، رونوشت های بزرگتر از 4 کیلوبایت نسبت به رونوشت های کوچک به ردیابی تخریب RNase حساس تر هستند.به منظور افزایش پایداری نمونه RNA ذخیره شده، RNA را می توان در یک متالمامین یونی حل کرد و 70- درجه سانتیگراد ذخیره می شود.تیلید مورد استفاده برای ذخیره RNA نباید حاوی جسم متفرقه ای باشد که RNA را تجزیه می کند.RNA که از لوزالمعده مشتق شده است را می توان حداقل برای یک سال در متالمامین ذخیره کرد.هنگامی که آماده استفاده از RNA هستید، می توانید از روش های زیر برای رسوب RNA استفاده کنید: NaCl را به 0.2 متر و 4 برابر حجم اتانول اضافه کنید، در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه قرار دهید و 10000 × گرم را به مدت 5 دقیقه گریز از مرکز قرار دهید.

2. از رونوشت معکوس بدون فعالیت RNaseH (RNaseH-) استفاده کنید:

مهارکننده‌های RNase اغلب به واکنش‌های رونویسی معکوس اضافه می‌شوند تا طول و بازده سنتز cDNA را افزایش دهند.بازدارنده RNase در اولین واکنش سنتز زنجیره ای در حضور بافرها و عوامل کاهنده مانند DTT اضافه می شود زیرا فرآیند سنتز قبل از cDNA مهار کننده را دناتوره می کند و در نتیجه RNase های متصل را آزاد می کند که RNA را تجزیه می کنند.مهارکننده پروتئین RNase فقط از تجزیه RNA توسط RNase A, B, C جلوگیری می کند و از ایجاد RNase بر روی پوست جلوگیری نمی کند، بنابراین باید مراقب بود که با وجود استفاده از این مهارکننده ها RNase از انگشتان وارد نشود.

ترانس کریپتاز معکوس تبدیل RNA به cDNA را کاتالیز می کند.هر دو M-MLV و AMV علاوه بر فعالیت پلیمراز خود دارای فعالیت RNaseH درون زا هستند.فعالیت RNaseH با فعالیت پلیمراز برای رشته های هتروزیگوت تشکیل شده بین قالب های RNA و آغازگرهای DNA یا رشته های گسترش cDNA رقابت می کند و رشته های RNA: RNA را در کمپلکس های DNA تجزیه می کند.الگوهای RNA تجزیه شده توسط فعالیت RNaseH دیگر نمی توانند به عنوان سوبستراهای موثر برای سنتز cDNA استفاده شوند و بازده و طول سنتز cDNA را کاهش دهند.بنابراین حذف یا کاهش بسیار زیاد فعالیت RNaseH ترانس کریپتاز معکوس سود زیادی خواهد داشت.

ترانس کریپتاز معکوس SuperScriptⅡ، رونوشت معکوس MMLV از RNaseH- و رونوشت معکوس thermoScript، AMV از RNaseH- cDNA تمام طول بیشتری نسبت به MMLV و AMV به همراه داشت.حساسیت RT-PCR تحت تأثیر مقدار cDNA سنتز شده است.ThermoScript بسیار حساس تر از AMV است.اندازه محصولات RT-PCR به دلیل توانایی ترانس کریپتاز معکوس برای سنتز cDNA محدود می شود، به خصوص هنگام شبیه سازی Cdna های بزرگتر.در مقایسه با MMLV، SuperScripⅡ به طور قابل توجهی بازده محصولات طولانی RT-PCR را افزایش داد.ترانس کریپتاز معکوس RNaseH- نیز پایداری حرارتی را افزایش می دهد، بنابراین واکنش را می توان در دمای بالاتر از حد طبیعی 37-42 درجه سانتیگراد انجام داد.تحت شرایط سنتز پیشنهادی، پرایمرهای oligo(dT) و 10μCi [alpha-p]dCTP استفاده شد.تولید کل زنجیره اول با استفاده از روش بارش TCA محاسبه شد.cDNA تمام طول با استفاده از حذف نوارهای مرتب شده بر اساس اندازه و شمارش در ژل آگارز قلیایی تجزیه و تحلیل شد.

3. دمای حفظ حرارت رونویسی معکوس را افزایش دهید:

دمای نگهداری بالاتر به باز شدن ساختار ثانویه RNA و افزایش بازده واکنش کمک می کند.برای اکثر الگوهای RNA، نگه داشتن RNA و پرایمر در دمای 65 درجه سانتیگراد بدون بافر یا نمک و سپس سرد کردن سریع آنها روی یخ، اکثر ساختارهای ثانویه را از بین می برد و به پرایمرها اجازه می دهد تا متصل شوند.با این حال، برخی از الگوها هنوز ساختار ثانویه دارند، حتی پس از دناتوره شدن حرارتی.تقویت این قالب های دشوار را می توان با استفاده از ترنسکریپتاز معکوس ThermoScript و با قرار دادن واکنش رونوشت معکوس در دماهای بالاتر برای بهبود تقویت انجام داد.دمای نگهداری بالاتر همچنین می تواند ویژگی را افزایش دهد، به خصوص زمانی که سنتز cDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن (GSPS) انجام می شود (به فصل 3 مراجعه کنید).در صورت استفاده از GSP، مطمئن شوید که مقدار Tm پرایمر با دمای نگهداری مورد انتظار یکسان باشد.از پرایمرهای oligo(dT) و تصادفی بالای 60 درجه سانتیگراد استفاده نکنید.پرایمرهای تصادفی باید به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد قبل از افزایش به 60 درجه سانتیگراد نگه داشته شوند.علاوه بر استفاده از دماهای بالاتر رونویسی معکوس، ویژگی را می توان با انتقال مستقیم مخلوط RNA/پرایمر از دمای دناتوره 65 درجه سانتیگراد به دمای نگهداری رونویسی معکوس و افزودن مخلوط واکنش 2× از پیش گرم شده (سنتز شروع حرارتی cDNA) بهبود بخشید.این رویکرد به جلوگیری از جفت شدن پایه های بین مولکولی که در دماهای پایین تر رخ می دهد کمک می کند.استفاده از ابزار PCR، سوئیچ های دمایی زیادی را که برای RT-PCR لازم است، ساده می کند.

پلیمراز حرارتی تثبیت شده به عنوان DNA پلیمراز در حضور Mg2+ و RNA پلیمراز در حضور Mn2+ عمل می کند.این می تواند گرما را تا 65 درجه سانتیگراد نگه دارد.با این حال، حضور Mn2+ در طی PCR، وفاداری را کاهش می‌دهد، که باعث می‌شود Tth پلیمراز برای تقویت با دقت بالا، مانند شبیه‌سازی cDNA، مناسب نباشد.علاوه بر این، Tth در رونویسی معکوس کارایی کمتری دارد، که حساسیت را کاهش می‌دهد، و از آنجایی که یک آنزیم می‌تواند رونویسی معکوس و PCR را انجام دهد، واکنش‌های کنترلی بدون رونویسی معکوس نمی‌توانند برای تشخیص محصولات تقویت‌شده cDNA از محصولات DNA ژنومی آلوده استفاده شوند.

4. افزودنی که رونویسی معکوس را ترویج می کند:

افزودن مواد افزودنی، از جمله گلیسیرین و DMSO، به اولین واکنش سنتز زنجیره ای می تواند پایداری دو رشته اسید نوکلئیک را کاهش دهد و ساختار ثانویه RNA را باز کند.تا 20٪ گلیسیرین یا 10٪ DMSO را می توان بدون تأثیر بر فعالیت SuperScriptⅡ یا MMLV اضافه کرد.AMV همچنین می تواند تا 20٪ گلیسرول را بدون کاهش فعالیت تحمل کند.برای به حداکثر رساندن حساسیت RT-PCR در واکنش رونویسی معکوس SuperScriptⅡ، 10٪ گلیسرول را می توان اضافه کرد و در دمای 45 درجه سانتیگراد عایق بندی کرد.اگر 10/1 محصول واکنش پس رونویسی به PCR اضافه شود، غلظت گلیسرول در واکنش تقویت 0.4 درصد است که برای مهار PCR کافی نیست.

5. پردازش RNaseH:

حساسیت را می توان با درمان واکنش های سنتز cDNA با RNaseH قبل از PCR بهبود بخشید.برای برخی از الگوها، تصور می شود که RNA در واکنش سنتز cDNA از اتصال محصولات تقویت شده جلوگیری می کند، در این صورت تیمار RNaseH می تواند حساسیت را افزایش دهد.به طور کلی، درمان RNaseH برای تقویت یک الگوی هدف cDNA با طول نسبتاً طولانی، مانند اسکروز توبروسⅡ با کپی کم، مورد نیاز است.برای این الگوی دشوار، RNaseH سیگنال تولید شده توسط cDNA سنتز شده توسط SuperScriptⅡ یا AMV را افزایش داد.برای اکثر واکنش‌های RT-PCR، درمان RNaseH اختیاری است زیرا مرحله دناتوراسیون PCR عایق‌شده با دمای 95 درجه سانتیگراد معمولاً RNA را از کمپلکس RNA: DNA هیدرولیز می‌کند.

6. روش های بهبود یافته برای تشخیص مقادیر کم RNA:

RT-PCR به ویژه زمانی چالش برانگیز است که فقط مقادیر کمی از RNA در دسترس باشد.افزودن گلیکوژن به عنوان یک حامل در طول جداسازی RNA به افزایش بازده نمونه های کوچک کمک می کند.یک گلیکوژن بدون RNase را می توان همزمان با Trizol اضافه کرد.گلیکوژن محلول در آب است و می تواند در فاز آب با RNA باقی بماند تا به رسوب بعدی کمک کند.غلظت توصیه شده گلیکوژن بدون RNase برای نمونه های کمتر از 50 میلی گرم بافت یا 106 سلول کشت شده 250 میکروگرم بر میلی لیتر است.

افزودن BSA استیله به واکنش‌های رونویسی معکوس با استفاده از SuperScriptⅡ می‌تواند حساسیت را افزایش دهد و برای مقادیر کم RNA، کاهش مقدار SuperScriptⅡ و افزودن ۴۰ واحد بازدارنده نوکلئاز RnaseOut می‌تواند سطح تشخیص را بهبود بخشد.اگر گلیکوژن در جداسازی RNA استفاده شود، افزودن مهارکننده‌های BSA یا RNase برای معکوس کردن واکنش‌های رونویسی با استفاده از SuperScriptⅡ همچنان توصیه می‌شود.

Ⅱ. ویژگی RT-PCR را افزایش دهید

1. سنتز cNDA:

برای شروع سنتز cDNA رشته اول می توان از سه روش مختلف استفاده کرد و ویژگی نسبی هر روش بر مقدار و نوع cDNA سنتز شده تأثیر می گذارد.

روش پرایمر تصادفی کمترین ویژگی در بین سه روش است.پرایمرها در چندین مکان در سراسر رونوشت بازپخت می شوند تا cDNA کوتاه و جزئی تولید کنند.این روش اغلب برای به دست آوردن توالی های انتهایی 5' و cDNA از الگوهای RNA با نواحی ساختاری ثانویه یا با مکان های پایانی که ترانس کریپتاز معکوس نمی توانند تکثیر شوند، استفاده می شود.برای به دست آوردن طولانی ترین cDNA، نسبت پرایمرها به RNA در هر نمونه RNA باید به صورت تجربی تعیین شود.غلظت اولیه پرایمرهای تصادفی از 50 تا 250 نانوگرم در هر سیستم واکنش 20 میکرولیتری متغیر است.از آنجایی که cDNA سنتز شده از RNA کل با استفاده از پرایمرهای تصادفی عمدتاً RNA ریبوزومی است، پلی (A)+RNA به طور کلی به عنوان الگو انتخاب می شود.

شروع Oligo(dT) اختصاصی تر از آغازگرهای تصادفی است.با دم poly(A) موجود در انتهای 3 mRNA در اکثر سلول‌های یوکاریوتی هیبرید می‌شود.از آنجایی که poly(A)+RNA تقریباً 1% تا 2% از کل RNA است، مقدار و پیچیدگی cDNA بسیار کمتر از پرایمرهای تصادفی است.به دلیل ویژگی بالای آن، oligo(dT) معمولاً به بهینه سازی برای نسبت RNA به آغازگر و انتخاب پلی (A)+ نیاز ندارد.استفاده از 0.5μg oligo(dT) در هر 20μl سیستم واکنش توصیه می شود.oligo(dT)12-18 برای اکثر RT-PCR مناسب است.سیستم ThermoScript RT-PCR به دلیل پایداری حرارتی خوب، oligo(dT)20 را فراهم می کند و برای دماهای نگهداری بالاتر مناسب است.

آغازگرهای اختصاصی ژن (GSP) بهترین آغازگرهای اختصاصی برای مرحله رونویسی معکوس هستند.GSP یک الیگونوکلئوزید آنتی سنس است که می‌تواند به‌طور اختصاصی با توالی‌های مقصد RNA هیبرید شود، به‌جای اینکه همه Rnas را مانند آغازگرهای تصادفی یا الیگو(dT) بازپخت کند.قوانین مورد استفاده برای طراحی پرایمرهای PCR در طراحی واکنش رونویسی معکوس GSP نیز اعمال می شود.GSP می‌تواند همان دنباله‌ای باشد که پرایمر تقویت شده در انتهای mRNA3′، یا GSP می‌تواند به گونه‌ای طراحی شود که با پرایمر تقویت معکوس آنیل شود.برای برخی از اشیاء تقویت شده، طراحی بیش از یک پرایمر آنتی سنس برای RT-PCR موفق ضروری است زیرا ساختار ثانویه RNA هدف ممکن است از اتصال پرایمر جلوگیری کند.پیشنهاد می شود از 1pmol GSP آنتی سنس در اولین سیستم واکنش سنتز زنجیره ای 20 میکرولیتری استفاده شود.

2. دمای حفظ حرارت رونویسی معکوس را افزایش دهید:

به منظور استفاده کامل از ویژگی GSP، باید از ترانس کریپتاز معکوس با پایداری حرارتی بالا استفاده شود.ترانس کریپتاز معکوس پایدار در برابر حرارت را می توان در دماهای بالاتر برای افزایش سختی واکنش عایق بندی کرد.به عنوان مثال، اگر یک GSP در دمای 55 درجه سانتیگراد آنیل شود، اگر رونویسی معکوس در دمای 37 درجه سانتیگراد با سختی کم با استفاده از AMV یا M-MLV انجام شود، از ویژگی GSP به طور کامل استفاده نمی شود.با این حال، SuperScripⅡ و ThermoScript می توانند در دمای 50 درجه یا بالاتر واکنش نشان دهند، که محصولات غیر اختصاصی تولید شده در دماهای پایین تر را حذف می کند.برای حداکثر ویژگی، مخلوط RNA/پرایمر را می توان مستقیماً از دمای دناتوراسیون 65 درجه سانتیگراد به دمای نگهداری رونویسی معکوس با افزودن مخلوط واکنش 2 x از قبل گرم شده (شروع حرارتی سنتز cDNA) منتقل کرد.این به جلوگیری از جفت شدن پایه بین مولکول ها در دماهای پایین کمک می کند.استفاده از ابزار PCR بسیاری از تغییرات دمایی مورد نیاز برای RT-PCR را ساده می کند.

3. کاهش آلودگی DNA ژنومی:

یکی از مشکلات احتمالی RT-PCR این است که RNA DNA ژنومی را آلوده می کند.استفاده از روش های بهتر جداسازی RNA مانند معرف تریزول، آلودگی DNA ژنومی را در فرآورده های RNA کاهش می دهد.برای جلوگیری از محصولات تولید شده از DNA ژنومی، RNA را می توان با درجه تقویت DnasⅠ درمان کرد تا DNA آلوده قبل از رونویسی معکوس حذف شود.نمونه ها در دمای 65 درجه سانتیگراد در 2.0 میلی مولار EDTA به مدت 10 دقیقه نگهداری شدند تا هضم DNaseⅠ خاتمه یابد.EDTA یون های منیزیم را کلات می کند تا از هیدرولیز RNA وابسته به یون منیزیم که در دماهای بالا رخ می دهد جلوگیری کند.

به منظور جداسازی cDNA تکثیر شده از محصول تکثیر DNA ژنوم، می توان آغازگرهایی را طراحی کرد که به طور جداگانه با اگزون جدا شده بازپخت می شوند.محصولات PCR مشتق شده از cDNA کوتاه تر از محصولات حاصل از DNA ژنومی آلوده هستند.یک آزمایش کنترل‌شده بدون رونویسی معکوس نیز بر روی هر الگوی RNA انجام می‌شود تا مشخص شود آیا یک قطعه معین از DNA ژنومی یا cDNA است.محصولات PCR به دست آمده در غیاب رونویسی معکوس از ژنوم مشتق شده اند.

محصولات مرتبط

RT-PCR آسان^ᵀᴹمن (یک قدم)

- کیت یک مرحله ای رونویسی معکوس و PCR را قادر می سازد در یک لوله انجام شود.فقط نیاز به افزودن RNA الگو، پرایمرهای PCR خاص و ddH بدون RNase دارد.₂O.

تجزیه و تحلیل کمی RNA را می توان به سرعت و با دقت انجام داد.

-این کیت از یک معرف منحصر به فرد رونویسی معکوس Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase همراه با یک سیستم واکنش منحصر به فرد برای بهبود موثر بازده تقویت و ویژگی واکنش استفاده می کند.

-سیستم واکنش بهینه شده باعث می شود واکنش حساسیت تشخیص بالاتر، پایداری حرارتی قوی تر و تحمل بهتر داشته باشد.

RT Easy II (با GDNase) Master Premix برای سنتز CDNA رشته اول برای PCR Real Time با GDNase

-توانایی کارآمد برای حذف gDNA، که می تواند gDNA را در قالب در عرض 2 دقیقه حذف کند.

-سیستم رونویسی معکوس کارآمد، تنها 15 دقیقه طول می کشد تا سنتز اولین رشته cDNA کامل شود.

-قالب های پیچیده: قالب هایی با محتوای GC بالا و ساختار ثانویه پیچیده نیز می توانند با کارایی بالا معکوس شوند.

-سیستم رونویسی معکوس با حساسیت بالا، الگوهای سطح pg نیز می توانند cDNA با کیفیت بالا دریافت کنند.

-سیستم رونویسی معکوس پایداری حرارتی بالایی دارد، دمای واکنش بهینه 42 درجه سانتیگراد است و هنوز هم عملکرد رونویسی معکوس خوبی در 50 درجه سانتیگراد دارد.