ترانس کریپتازهای معکوس سنتی نمی توانند دماهای بالا را تحمل کنند (دمای بهینه برای فعالیت MMLV 37-50 درجه سانتی گراد و AMV 42-60 درجه سانتی گراد است).RNA ویروسی پیچیده‌تر را نمی‌توان به طور موثر در دماهای پایین به cDNA رونویسی معکوس کرد و در نتیجه کارایی تشخیص کاهش می‌یابد.RT-qPCR سنتی به طور کلی نیاز به مشارکت دو آنزیم کلیدی (ترانس کریپتاز معکوس و DNA پلیمراز) دارد که ساده کردن عملکرد سیستم واکنش و کاهش هزینه را غیرممکن می کند.در اینجا دو ترانس کریپتاز معکوس مقاوم در برابر دمای بالا، TtH و RevTaq را معرفی می کنیم.این دو آنزیم عملکرد DNA پلیمراز را نیز دارند، بنابراین به آنها آنزیم دو عملکردی می گویند.

TtH DNA پلیمراز

حتما درباره TtH شنیده اید که از باکتری گرمادوست Thermus thermophilus HB8 به دست می آید.در حضور کاتیون های دو ظرفیتی مانند Mg2+ دارای فعالیت DNA پلیمراز می باشد.این به طور گسترده در واکنش های PCR مانند آنزیم Taq استفاده می شود، اما مقاومت حرارتی بالاتری نسبت به آنزیم Taq دارد، بنابراین با الگوهای محتوای GC بالا نیز تأثیر بهتری بر PCR دارد.

· این آنزیم اساساً فعالیت اگزونوکلئازی 3'→5' و فعالیت اگزونوکلئازی 5'→3' ندارد، بنابراین می توان از آن برای توالی یابی دی اکسی نیز استفاده کرد.

· این آنزیم دارای فعالیت RTase است.در حضور Mn2+، فعالیت RTase افزایش خواهد یافت.با استفاده از این ویژگی می توان از آن برای انجام واکنش رونویسی معکوس و واکنش PCR در یک لوله، یعنی RT-PCR یک مرحله ای استفاده کرد.اما در حضور Mn2+ دقت RT-PCR زیاد نیست.فعالیت RT هیچ ارتباطی با فعالیت rnaase H ندارد.

· افزایش فعالیت Tth-DNA پلیمراز (pH9، بهینه +55 ℃ ~ 70 ℃، حداکثر + 95 ℃) بر مشکلات ناشی از ساختار ثانویه RNA غلبه می کند.cDNA حاصل را می توان با PCR با همان آنزیم در حضور یون های Mg2+ تکثیر کرد.

· توانایی Tth-DNA پلیمراز برای انجام رونویسی معکوس و تکثیر DNA در دماهای بالا باعث می شود که این آنزیم برای RT-PCR کمی، شبیه سازی و تجزیه و تحلیل بیان ژن RNA سلولی و ویروسی مفید باشد.
· Tth-DNA پلیمراز برای RT-PCR برای تقویت RNA تا 1kb استفاده می شود.

ویژگی ها و مزایا

Tth DNA پلیمراز:

• اطمینان حاصل کنید که اندازه محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بهینه شده، حداقل 1000 جفت باز در واکنش RT-PCR

• دئوکسی ریبونوکلئوزید تری فسفات اصلاح شده را به عنوان سوبسترا بپذیرید

• مرتبط با فعالیت RNase H نیست

• دارای پایداری حرارتی بالا برای غلبه بر مشکلات، معمولاً مربوط به ساختار ثانویه بالای موجود در RNA است

RevTaq RT-PCR DNA پلیمراز

یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت با فعالیت رونویسی معکوس

RevTaq-RT-PCR-DNA پلیمراز یک آنزیم مهندسی شده، بسیار مقاوم در برابر حرارت، دو عملکردی با فعالیت های رونوشت معکوس و DNA پلیمراز است که از طریق تکامل مستقیم و مصنوعی به دست می آید.

· نیمه عمر RevTaq RT-PCR DNA پلیمراز در دمای 95 درجه سانتیگراد بیشتر از 40 دقیقه است.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase امکان رونویسی معکوس در دمای بالا را مستقیماً از الگوی RNA فراهم می کند و مرحله رونویسی معکوس می تواند چندین بار تکرار شود تا الگوهای cDNA بیشتری تولید شود.

· RevTaq RT-PCR DNA پلیمراز اجازه RT-PCR «صفر» را می دهد (بدون مرحله رونویسی معکوس همدما)، زیرا در مرحله گسترش PCR حلقوی، رونویسی معکوس و تقویت DNA به طور همزمان اتفاق می افتد.این همچنین واکنش رونویسی معکوس را در دماهای بالا ترویج می‌کند و در نتیجه مشکلاتی را که در ذوب ساختار ثانویه قوی در RNA در دماهای بالا وجود دارد به حداقل می‌رساند.

· با توجه به فرمول شروع داغ مبتنی بر آپتامر، RevTaq RT-PCR DNA پلیمراز زمانی که دمای بازپخت و گسترش بالاتر از 57 درجه سانتیگراد باشد، نتایج بهتری ایجاد خواهد کرد.

· از آنجایی که آنزیم در برابر حرارت مقاوم است، طراحی پرایمرها و پروب هایی با نقطه ذوب بسیار بالا (>60 درجه سانتی گراد) توصیه می شود.

· توصیه می شود دمای مرحله بازپخت / گسترش را از طریق یک گرادیان دما در طول فرآیند تنظیم واکنش بهینه کنید.

· هر چه دما بیشتر باشد، ویژگی PCR بیشتر است.چرخه رونویسی معکوس معمولاً در دمای بالاتر از چرخه PCR انجام می شود، زیرا هیبریداسیون DNA Primer:RNA Template معمولا نقطه ذوب بالاتری نسبت به DNA Primer:cDNA Template duplex دارد.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase از نظر ژنتیکی مهندسی شده و بهینه شده است و اندازه آمپلیکون بین 60-300 جفت باز است.

حد تشخیص DNA پلیمراز RevTaq RT-PCR به 4 نسخه می رسد/

سیستم واکنش بهینه (استقرار آغازگرهای نقطه ذوب بالا) در شکل نشان داده شده است.RT-PCR مبتنی بر DNA پلیمراز RevTaq RT-PCR حساسیت بهتری نسبت به ترکیب اصلی RT-qPCR 1 مرحله ای TaqPath و گرادیان رقت نمونه با تشخیص کمتر نشان می دهد.

مزایای بیشتر:

عملکرد شروع سریع ← مرحله دناتوراسیون حرارتی اولیه را می توان نادیده گرفت.

فرمول آپتامر با شروع داغ ← ارائه 100% فعالیت آنزیمی بلافاصله و جلوگیری از تقویت غیر اختصاصی در دماهای پایین (<57 درجه سانتیگراد).

تابع برش → مرحله استخراج RNA حذف شده است، زیرا RevTaq RT-PCR DNA پلیمراز همچنین می تواند نمونه های واکنش خام را پردازش کند.این می تواند بلافاصله غشای سلولی یوکاریوت ها، باکتری ها و ویروس ها را در یک چرخه RT-PCR داغ از بین ببرد.

سطح مواد خام IVD → استانداردهای کیفیت بالا و قیمت های بسیار رقابتی