• PCR روشی است که برای تکثیر DNA از مقدار کمی الگوی DNA استفاده می شود.RT-PCR از رونویسی معکوس برای تولید یک الگوی DNA از منبع RNA استفاده می کند که می تواند سپس تقویت شود.
• PCR و RT-PCR معمولاً واکنش‌های نقطه پایانی هستند، در حالی که qPCR و RT-qPCR از سینتیک سرعت سنتز محصول در طول واکنش PCR برای کمی کردن مقدار الگوی موجود استفاده می‌کنند.
• روش های جدیدتر، مانند PCR دیجیتال، کمیت مطلق الگوی DNA اولیه را ارائه می دهند، در حالی که روش هایی مانند PCR همدما نیاز به تجهیزات گران قیمت را برای ارائه نتایج قابل اعتماد کاهش می دهند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک بیولوژی مولکولی نسبتاً ساده و پرکاربرد برای تقویت و شناسایی توالی‌های DNA و RNA است.در مقایسه با روش‌های سنتی شبیه‌سازی و تکثیر DNA، که اغلب ممکن است روزها طول بکشد، PCR تنها به چند ساعت نیاز دارد.PCR بسیار حساس است و برای تشخیص و تقویت توالی های خاص به حداقل قالب نیاز دارد.روش های اساسی PCR از تشخیص ساده DNA و RNA بیشتر پیشرفت کرده اند.در زیر، ما یک نمای کلی از روش‌های مختلف PCR و معرف‌هایی که در Enzo Life Sciences برای نیازهای تحقیقاتی شما ارائه می‌کنیم، ارائه کرده‌ایم.هدف ما کمک به دانشمندان برای دسترسی سریع به معرف های PCR برای استفاده در پروژه تحقیقاتی بعدی خود است!

PCR

برای PCR استاندارد، تنها چیزی که نیاز دارید یک DNA پلیمراز، منیزیم، نوکلئوتیدها، پرایمرها، الگوی DNA برای تقویت و یک ترموسایکلر است.مکانیسم PCR به اندازه هدف آن ساده است: 1) DNA دو رشته ای (dsDNA) گرما دناتوره می شود، 2) پرایمرها با رشته های DNA منفرد همراستا می شوند و 3) پرایمرها توسط DNA پلیمراز گسترش می یابند که منجر به دو نسخه از DNA می شود. رشته DNA اصلیفرآیند دناتوره شدن، بازپخت و طویل شدن طی یک سری دما و زمان به عنوان یک چرخه تقویت شناخته می شود (شکل 1).

هر مرحله از چرخه باید برای قالب و مجموعه پرایمر استفاده شده بهینه شود.این چرخه تقریباً 20 تا 40 بار تکرار می شود و محصول تقویت شده را می توان به طور معمول توسط ژل آگارز تجزیه و تحلیل کرد (شکل 2).

از آنجایی که PCR یک روش بسیار حساس است و حجم بسیار کمی برای واکنش های منفرد مورد نیاز است، تهیه یک مخلوط اصلی برای چندین واکنش توصیه می شود.مخلوط اصلی باید به خوبی مخلوط شود و سپس بر اساس تعداد واکنش ها تقسیم شود، تا اطمینان حاصل شود که هر واکنش حاوی همان مقدار آنزیم، dNTPs و آغازگرها خواهد بود.بسیاری از تامین کنندگان، مانند Enzo Life Sciences، مخلوط های PCR را نیز ارائه می دهند که از قبل حاوی همه چیز به جز پرایمرها و الگوی DNA هستند.

نواحی غنی از گوانین/سیتوزین (غنی از GC) یک چالش در تکنیک های استاندارد PCR است.توالی های غنی از GC پایدارتر از توالی هایی با محتوای GC کمتر هستند.علاوه بر این، توالی های غنی از GC تمایل به تشکیل ساختارهای ثانویه، مانند حلقه های سنجاق سر دارند.در نتیجه جدا شدن کامل رشته های دوگانه غنی از GC در مرحله دناتوراسیون دشوار است.در نتیجه، DNA پلیمراز نمی تواند رشته جدید را بدون مانع سنتز کند.دمای دناتوراسیون بالاتر می تواند این را بهبود بخشد، و تنظیمات به سمت دمای بازپخت بالاتر و زمان بازپخت کوتاه تر می تواند از اتصال غیر اختصاصی پرایمرهای غنی از GC جلوگیری کند.معرف های اضافی می توانند تقویت توالی های غنی از GC را افزایش دهند.DMSO، گلیسرول و بتائین به برهم زدن ساختارهای ثانویه ناشی از فعل و انفعالات GC کمک می کنند و در نتیجه جداسازی رشته های دوتایی را تسهیل می کنند.

Hot Start PCR

تقویت نامشخص مشکلی است که می تواند در حین PCR رخ دهد.اکثر DNA پلیمرازهایی که برای PCR استفاده می شوند در دمای حدود 68 تا 72 درجه سانتی گراد بهترین عملکرد را دارند.با این حال، آنزیم می تواند در دماهای پایین تر نیز فعال باشد، هرچند در درجه پایین تر.در دماهای بسیار کمتر از دمای بازپخت، پرایمرها می توانند به طور غیر اختصاصی متصل شوند و منجر به تقویت غیر اختصاصی شوند، حتی اگر واکنش روی یخ تنظیم شود.می توان با استفاده از مهارکننده های پلیمراز که تنها پس از رسیدن به دمای معین از DNA پلیمراز جدا می شوند، از این امر جلوگیری کرد، از این رو اصطلاح PCR شروع گرم می باشد.بازدارنده می تواند آنتی بادی باشد که به پلیمراز متصل می شود و در دمای دناتوراسیون اولیه (معمولاً 95 درجه سانتیگراد) دناتوره می شود.

پلیمراز با کیفیت بالا

در حالی که DNA پلیمرازها با دقت نسبتاً زیادی به دنباله الگوی اصلی تقویت می شوند، ممکن است اشتباهاتی در تطابق نوکلئوتیدی رخ دهد.عدم تطابق در برنامه‌هایی مانند شبیه‌سازی می‌تواند منجر به رونوشت‌های کوتاه‌شده، و ترجمه اشتباه یا پروتئین‌های غیرفعال در پایین دست شود.برای جلوگیری از این عدم تطابق، پلیمرازهایی با فعالیت "تصحیح" شناسایی و در جریان کار گنجانده شده اند.اولین پلیمراز تصحیح کننده، Pfu، در سال 1991 در Pyrococcus furiosus شناسایی شد.این آنزیم Pfu دارای فعالیت اگزونوکلئاز 3 تا 5 است.همانطور که DNA تکثیر می شود، اگزونوکلئاز نوکلئوتیدهای نامتناسب را در انتهای 3' رشته حذف می کند.سپس نوکلئوتید صحیح جایگزین می شود و سنتز DNA ادامه می یابد.شناسایی توالی های نوکلئوتیدی نادرست بر اساس میل اتصال به تری فسفات نوکلئوزیدی صحیح با آنزیم است، جایی که اتصال ناکارآمد سنتز را کند می کند و امکان جایگزینی صحیح را فراهم می کند.فعالیت تصحیح پلیمراز Pfu منجر به خطاهای کمتری در توالی نهایی در مقایسه با Taq DNA پلیمراز می شود.در سال‌های اخیر، آنزیم‌های تصحیح‌کننده دیگری شناسایی شده‌اند و تغییراتی در آنزیم اصلی Pfu برای کاهش بیشتر میزان خطا در طی تکثیر DNA انجام شده است.

RT-PCR

PCR رونویسی معکوس یا RT-PCR، امکان استفاده از RNA را به عنوان الگو فراهم می کند.یک مرحله اضافی امکان تشخیص و تقویت RNA را فراهم می کند.RNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس به DNA مکمل (cDNA) رونویسی معکوس می شود.کیفیت و خلوص الگوی RNA برای موفقیت RT-PCR ضروری است.اولین مرحله RT-PCR، سنتز هیبرید DNA/RNA است.ترانس کریپتاز معکوس همچنین دارای یک تابع RNase H است که بخش RNA هیبرید را تخریب می کند.سپس مولکول DNA تک رشته ای با فعالیت DNA پلیمراز وابسته به DNA از رونوشت معکوس به cDNA تکمیل می شود.راندمان واکنش رشته اول می تواند بر روند تقویت تأثیر بگذارد.از اینجا به بعد، روش استاندارد PCR برای تقویت cDNA استفاده می شود.امکان برگرداندن RNA به cDNA توسط RT-PCR دارای مزایای زیادی است و در درجه اول برای تجزیه و تحلیل بیان ژن استفاده می شود.RNA تک رشته ای و بسیار ناپایدار است که کار با آن را چالش برانگیز می کند.معمولاً به عنوان اولین مرحله در qPCR عمل می کند که رونوشت های RNA را در یک نمونه بیولوژیکی کمی می کند.

qPCR و RT-qPCR

PCR کمی (qPCR) برای شناسایی، تعیین و تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک برای کاربردهای متعدد استفاده می شود.در RT-qPCR، رونوشت‌های RNA اغلب با رونویسی معکوس آنها در cDNA، همانطور که در بالا توضیح داده شد، اندازه‌گیری می‌شوند و سپس qPCR متعاقبا انجام می‌شود.همانند PCR استاندارد، DNA با سه مرحله تکراری تقویت می شود: دناتوراسیون، بازپخت و ازدیاد طول.با این حال، در qPCR، برچسب زدن فلورسنت جمع آوری داده ها را با پیشرفت PCR امکان پذیر می کند.این تکنیک به دلیل طیف وسیعی از روش ها و شیمی های موجود، مزایای زیادی دارد.

در qPCR مبتنی بر رنگ (معمولاً سبز)، برچسب‌گذاری فلورسنت امکان تعیین کمی مولکول‌های DNA تقویت‌شده را با استفاده از رنگ اتصال dsDNA فراهم می‌کند.در طول هر چرخه، فلورسانس اندازه گیری می شود.سیگنال فلورسانس متناسب با مقدار DNA تکثیر شده افزایش می یابد.از این رو، DNA در "زمان واقعی" کمیت می شود (شکل 3).معایب qPCR مبتنی بر رنگ این است که تنها یک هدف را می توان در یک زمان مورد بررسی قرار داد و اینکه رنگ به هر ds-DNA موجود در نمونه متصل می شود.

در qPCR مبتنی بر پروب، بسیاری از اهداف را می توان به طور همزمان در هر نمونه شناسایی کرد، اما این امر مستلزم بهینه سازی و طراحی یک پروب(های) خاص هدف است که علاوه بر پرایمرها استفاده می شود.انواع مختلفی از طرح های کاوشگر موجود است، اما رایج ترین نوع، پروب هیدرولیز است که دارای فلوروفور و خاموش کننده است.انتقال انرژی تشدید فلورسانس (FRET) از انتشار فلوروفور از طریق کوئنچر در حالی که پروب دست نخورده است جلوگیری می کند.با این حال، در طی واکنش PCR، پروب در طول گسترش پرایمر و تقویت توالی خاصی که به آن متصل است، هیدرولیز می شود.برش پروب فلوروفور را از خاموش کننده جدا می کند و منجر به افزایش وابسته به تقویت در فلورسانس می شود (شکل 4).بنابراین، سیگنال فلورسانس از یک واکنش qPCR مبتنی بر پروب متناسب با مقدار توالی هدف پروب موجود در نمونه است.از آنجایی که qPCR مبتنی بر پروب خاص‌تر از qPCR مبتنی بر رنگ است، این فناوری اغلب در سنجش‌های تشخیصی مبتنی بر qPCR استفاده می‌شود.

تقویت همدما

تکنیک‌های PCR که در بالا ذکر شد به تجهیزات گران‌قیمت ترموسایکلینگ نیاز دارد تا دمای محفظه را با دقت بالا و پایین برای مراحل دناتوراسیون، بازپخت و گسترش افزایش دهد.تعدادی از تکنیک ها توسعه یافته اند که نیازی به چنین دستگاه های دقیقی ندارند و می توانند در یک حمام آب ساده یا حتی در سلول های مورد نظر انجام شوند.این تکنیک ها در مجموع تقویت همدما نامیده می شوند و بر اساس تقویت نمایی، خطی یا آبشاری کار می کنند.

شناخته شده ترین نوع تقویت همدما، تقویت همدما با واسطه حلقه یا LAMP است.LAMP از تقویت نمایی در دمای 65⁰C برای تقویت DNA یا RNA الگو استفاده می کند.هنگام اجرای LAMP، چهار تا شش آغازگر مکمل نواحی DNA هدف با یک DNA پلیمراز برای سنتز DNA جدید استفاده می شود.دو تا از این آغازگرها دارای توالی‌های مکمل هستند که توالی‌ها را در پرایمرهای دیگر تشخیص می‌دهند و آن‌ها را متصل می‌کنند، که اجازه می‌دهد یک ساختار "حلقه" در DNA تازه سنتز شده تشکیل شود که سپس به بازپخت پرایمر در دورهای بعدی تقویت کمک می‌کند.LAMP را می توان با روش های متعددی از جمله فلورسانس، الکتروفورز ژل آگارز یا رنگ سنجی مشاهده کرد.سهولت تجسم و تشخیص وجود یا عدم وجود محصول توسط رنگ سنجی و نبود تجهیزات گران قیمت مورد نیاز، LAMP را به گزینه ای مناسب برای آزمایش SARS-CoV-2 در مناطقی که آزمایش آزمایشگاهی بالینی به راحتی در دسترس نبود، یا ذخیره و حمل و نقل نمونه ها تبدیل کرده است. امکان پذیر نبود یا در آزمایشگاه هایی که قبلاً تجهیزات ترموسایکلینگ PCR نداشتند.