RNase کلمه حساسی است که بسیاری از دانش‌آموزانی که اغلب آزمایش‌های استخراج RNA را انجام می‌دهند، مایل به شنیدن آن نیستند.به طور کامل مسلح، RNA که در نهایت با معرف های بسیار سمی فنل و کلروفرم استخراج شده بود، تجزیه شد.من آشتی ندارم!!!امروز، بیایید نگاهی به منشا Rnase معروف بیندازیم.

ریبونوکلئاز (RNase) یا RNase، یک نوکلئاز است که می تواند RNA را به مولکول های کوچک هیدرولیز کند.RNase، به عنوان یک پروتئین مولکولی کوچک، به طور غیرعادی پایدار است .استریلیزاسیون بخار با دمای بالا و فشار بالا معمولی و مهارکننده های پروتئینی نمی توانند آن را به طور کامل غیرفعال کنند.پایداری RNase عمدتاً از پیوندهای دی سولفید در ساختار ناشی می شود.به عنوان مثال، RNase معمولاً مورد استفاده در پانکراس گاوی تنها دارای 124 اسید آمینه است، اما حاوی 4 پیوند دی سولفید است.پیوند گوگردی و پیوند دی سولفیدی به RNase پایداری حرارتی عالی می بخشد.علاوه بر این، rnase وزن مولکولی نسبتا کمی دارد و در بسیاری از موارد می تواند به سرعت ترکیب اولیه خود را بازیابی کند.

علاوه بر پایداری فوق العاده،RNaseها در آزمایشگاه همه جا وجود دارند .RNase یک مکانیسم دفاعی بیولوژیکی است.برای یک سلول، RNA اگزوژن اغلب کشنده است.در مقایسه با DNA اگزوژن، RNA اگزوژن اغلب خطرناک تر است.RNA با خوشحالی رونویسی و ترجمه می شود، بنابراین تقریباً همه ارگانیسم ها RNases را برای دفاع در برابر تهاجم RNA اگزوژن ایجاد کرده اند.بنابراین، سلول های باکتریایی که در آزمایشگاه کشت می شوند و شما که RNA را استخراج می کنید، رایحه RNase را متصاعد می کنید.مایعات بدن انسان (بزاق، اشک و غیره) حاوی مقدار زیادی RNase هستند، بنابراین وقتی RNA تجزیه می شود گریه نکنید.هر چه بیشتر گریه کنید، تخریب RNA بدتر است!!خواهر دایو برای استخراج RNA مناسب نیست!

علاوه بر این، پوست ظریف شما حاوی مقدار زیادی RNase است و نشانگرها، پیپت ها، درهای یخچال و دستگیره های درهایی که با پوست لمس شده اند نیز حاوی RNase هستند.

با این همه سر و صدا، بیایید نگاهی به نحوه برخورد با RNase ها بیاندازیم.

اولین چیزی که همه هنگام حذف RNA به آن فکر می کنند این استDEPC(دی اتیل پیروکربنات).DEPC عمدتاً پروتئین را با ترکیب با حلقه ایمیدازول هیستیدین گروه فعال RNase دناتوره می کند و در نتیجه فعالیت آنزیم را مهار می کند.0.1% DEPC می تواند اثر حذف بهتری روی Rnase داشته باشد، اما باید توجه داشته باشیم که DEPC یک سرطان زا شناخته شده است، بنابراین هنگام استفاده از آن باید توجه ویژه ای داشت.

برای RNase، باید از دو جنبه شروع کنیم،اولین مورد مهار فعالیت RNase درون زا است

معرف های استخراج RNA معمولی مانند گوانیدین ایزوتیوسیانات و DTT موجود در تریزول می توانند پیوند دی سولفیدی RNase را باز کنند، اما همچنان برخی از RNase ها به خصوص در نمونه های بافتی وجود دارد، بنابراین به دمای پایین توجه کنید.

1.نمونه بافت را پس از بیرون آوردن بلافاصله در نیتروژن مایع یا در محلول تجاری نگهداری RNA غوطه ور کنید.

2.پس از استخراج RNA نمونه سلول، آن را به محلول لیز اضافه کرده و روی جعبه یخ لیز کنید.

3. بهتر است از نیتروژن مایع برای آسیاب استفاده شود زمانی که نمونه های بافت همگن می شوند.هنگام استفاده از هموژنایزر برقی بدون نیتروژن مایع، به پیش سرد شدن کامل آداپتور همگن توجه کنید.

دومی DNase اگزوژن است

1.کاملا مسلح باشید، کت آزمایشگاه بپوشید، ماسک بزنید و حتما یک جفت دستکش نو بپوشید (اینقدر صرفه جویی نکنید!! لازم به ذکر است که تریزول فوق العاده خورنده است و همچنین از طریق دستکش بسیار قوی است، پس روی دستتان چکه نریزید).

2.تمام نوک پیپت های استفاده شده، لوله های EP، لوله های PCR و سایر تجهیزات باید با RNase درمان شوند.می توان آن را در 0.1% DEPC خیس کرد و سپس تحت فشار بالا تحت فشار قرار داد.به عملکرد در هود بخار توجه کنید.ظالمان محلی می توانند مستقیماً مواد مصرفی برای حذف آنزیم ها خریداری کنند.

PS: اجازه دهید یک روش تنبل را به شما بگویم.اگرچه دمای بالا و فشار بالا نمی تواند RNase را به طور کامل حذف کند، اما بخش بزرگی از آن را حذف می کند.2 برابر دمای بالا و فشار بالا تأثیر خوبی دارد و استخراج RNA تأثیر کمی دارد.

3.الکل می تواند پروتئین ها را تغییر شکل دهد،بنابراین جدول استخراج RNA را می توان با الکل 75 درصد پاک کرد و دستکش را نیز می توان با الکل پاشید.

4.محلول نهایی حل کننده RNA و لوله سانتریفیوژ نیز باید از RNase استفاده شود.آب DEPC یک محلول حل کننده RNA است که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرد.بیایید در مورد روش درست تهیه آب DEPC صحبت کنیم (به یاد داشته باشید هنگام خرید DEPC تجاری را دوباره بسته بندی کنید)

DEPC را در 1:1000 به آب فوق خالص اضافه کنید، خوب تکان دهید، بگذارید یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد بماند و در دمای 121 درجه سانتیگراد در دمای بالا و فشار بالا به مدت 15 دقیقه استریل کنید.آب DEPC را می توان در 20- درجه سانتی گراد در مقادیر 1 میلی لیتر ذخیره کرد.

در نهایت، به طور خلاصه: دمای پایین کلید است، مواد مصرفی به خوبی مدیریت می شوند، کاملا مسلح هستند و کمتر صحبت می کنند!

خوب، این برای استراتژی امروز است.برای شما تمام غلظت و خلوص RNA که ذکر کردید آرزو می کنم.هر دو A260/A280 2.0 هستند!!!

البته اگر از الف استفاده کنیدکیت استخراج RNA عملیات دمای اتاق، ممکن است با مشکلات فوق مواجه نشوید.

عملیات در دمای اتاق، بدون افزودن DNase، RNA کل سلول ها را در 11 دقیقه استخراج می کند و RNA کل را از بافت های حیوانی یا گیاهان در 30 دقیقه استخراج می کند.

برای نمونه های آزمایشی، لطفا تماس بگیرید:overseas@foregene.com

محصولات مرتبط:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/