در آزمایشات qPCR، طراحی پرایمر نیز پیوند بسیار مهمی است.اینکه پرایمرها مناسب هستند یا نه، ارتباط نزدیکی با این دارد که آیا راندمان تقویت به استاندارد می رسد، آیا محصولات تقویت شده خاص هستند و آیا نتایج تجربی در دسترس هستند یا خیر.
بنابراین چگونه می توان ویژگی پرایمر qPCR را بهتر کرد؟راندمان تقویت بالا؟
امروز، شما را به طراحی پرایمرهای qPCR با هم می بریم و اجازه می دهیم طراحی پرایمر qPCR به یک مهارت علمی کارآمد در آزمایش ها تبدیل شود.
هنگام طراحی پرایمرهای qPCR معمولاً به نکات زیر توجه کنید: پرایمرها باید تا حد امکان در عرض اینترون طراحی شوند، طول محصول باید 100-300 جفت باز باشد، مقدار Tm باید تا حد امکان نزدیک به 60 درجه سانتیگراد باشد، پرایمرهای بالادست و پایین دست باید تا حد امکان نزدیک باشند و انتهای پرایمر باید G یا C و غیره باشد.
1. طراحی پرایمرهای پوشاننده اینترون
هنگام طراحی پرایمرهای qPCR، انتخاب پرایمرهای طراحی شده روی اینترون‌ها می‌تواند از تکثیر الگوی gDNA جلوگیری کند، و محصولات همگی از تقویت cDNA مشتق شده‌اند، بنابراین تأثیر آلودگی gDNA را از بین می‌برند.
2. طول پرایمر
طول پرایمر به طور کلی بین 18-30 nt است و طول محصول تقویتی باید تا حد امکان بین 100-300 جفت باز کنترل شود.
اگر پرایمر خیلی کوتاه باشد منجر به تقویت غیر اختصاصی می شود و در صورت طولانی بودن به راحتی ساختار ثانویه (مانند ساختار سنجاق سر) را تشکیل می دهد.اگر محصول تقویت بیش از حد طولانی باشد، برای واکنش پلیمراز مناسب نیست، که بر راندمان تقویت PCR تأثیر می گذارد.
3. محتوای GC و مقدار Tm
میزان GC پرایمرها باید بین 40 تا 60 درصد کنترل شود.اگر خیلی زیاد یا خیلی کم باشد، برای شروع واکنش مناسب نیست.مقدار GC پرایمرهای فوروارد و معکوس باید نزدیک به یک باشد تا مقدار Tm و دمای بازپخت یکسان به دست آید.
مقدار Tm باید تا حد امکان بین 55-65 درجه سانتیگراد باشد، معمولاً حدود 60 درجه سانتیگراد، و مقدار Tm در بالادست و پایین دست باید تا حد امکان نزدیک باشد، ترجیحاً بیش از 4 درجه سانتیگراد نباشد.
4. از انتخاب A در انتهای 3′ پرایمر خودداری کنید
هنگامی که انتهای 3 این پرایمر با هم مطابقت نداشته باشد، تفاوت های زیادی در راندمان سنتز پایه های مختلف وجود دارد.هنگامی که آخرین پایه A باشد، حتی در صورت عدم تطابق نیز می تواند سنتز زنجیره ای را آغاز کند، و زمانی که آخرین پایه T باشد، بازده القای عدم تطابق بسیار کاهش می یابد.بنابراین سعی کنید از انتخاب A در انتهای 3′ پرایمر خودداری کنید و بهتر است T را انتخاب کنید.
اگر پرایمر پروب باشد، انتهای 5 این پروب نمی تواند G باشد، زیرا حتی زمانی که یک پایه G منفرد به گروه گزارشگر فلورسنت FAM متصل می شود، G می تواند سیگنال فلورسنت ساطع شده توسط گروه FAM را خاموش کند و نتیجه منفی کاذب خواهد داشت.به نظر می رسد.
5. توزیع پایه
توزیع چهار پایه در پرایمر ترجیحاً تصادفی است و از بیش از 3 G یا C متوالی در انتهای 3' و بیش از 3 متوالی اجتناب می شود.G یا C به راحتی در ناحیه توالی غنی از GC ایجاد جفت می شود.
6. منطقه طراحی پرایمر باید از ساختارهای ثانویه پیچیده اجتناب کند.
ساختار ثانویه تشکیل شده توسط تک رشته محصول تقویتی بر پیشرفت روان PCR تأثیر می گذارد.با پیش بینی وجود ساختار ثانویه در توالی هدف از قبل، سعی کنید از این ناحیه در طراحی پرایمرها اجتناب کنید.
7. خود پرایمرها و بین پرایمرها باید سعی کنند از پایه های مکمل متوالی اجتناب کنند.
هیچ مکمل 4 پایه متوالی بین خود پرایمر و پرایمر وجود ندارد.خود پرایمر نباید دنباله ای مکمل داشته باشد، در غیر این صورت خود را تا می کند و ساختار سنجاق سر را تشکیل می دهد که بر ترکیب آنیل پرایمر و قالب تأثیر می گذارد.
توالی های مکمل نمی توانند بین آغازگرهای بالادست و پایین دست وجود داشته باشند.مکمل بودن بین پرایمرها باعث تولید دایمرهای پرایمر می شود که باعث کاهش کارایی PCR و حتی بر دقت کمی می شود.اگر ساختارهای پرایمر-دایمر و سنجاق سر اجتناب ناپذیر است، مقدار △G نباید خیلی زیاد باشد (باید کمتر از 4.5 کیلوکالری در مول باشد).
8. پرایمرها محصول خاص هدف را تقویت می کنند.
هدف نهایی تشخیص qPCR درک فراوانی ژن هدف است.اگر تقویت غیر اختصاصی رخ دهد، کمی سازی نادرست خواهد بود.بنابراین، پس از طراحی پرایمرها، باید توسط BLAST آزمایش شوند و ویژگی محصولات در پایگاه داده توالی مقایسه شود.
در مرحله بعد، ژن GAS6 انسانی (6 خاص توقف رشد) را به عنوان مثال برای طراحی پرایمرهای qPCR در نظر می گیریم.
ژن پرس و جو 01
Homo GAS6از طریق NCBIدر اینجا باید به مقایسه نام ژن و گونه ها توجه کنیم تا از سازگاری آنها اطمینان حاصل کنیم.
02 توالی ژن را پیدا کنید
(1) اگر توالی هدف DNA ژنومی است، اولین مورد را انتخاب کنید که توالی DNA ژنومی ژن است.
(2) اگر دنباله هدف mRNA است، دومی را انتخاب کنید.پس از وارد کردن، روی «CDS» در جدول زیر کلیک کنید.توالی پس زمینه قهوه ای توالی کد کننده ژن است.
03 پرایمرهای طراحی
رابط Primer-BLAST را وارد کنید
شماره توالی ژن یا توالی را با فرمت Fasta در سمت چپ بالا وارد کنید و پارامترهای مربوطه را پر کنید.

روی «دریافت پرایمرها» کلیک کنید و NCBI ظاهر می‌شود تا به شما بگوید که چنین انتخاب پارامتری به سایر انواع اتصال تقویت می‌شود.ما می توانیم انواع مختلف اتصال را بررسی کرده و آنها را برای بدست آوردن جفت پرایمر مناسب ارسال کنیم (همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است).اجرای این فرآیند ممکن است ده ها ثانیه طول بکشد.
دمای بازپخت این جفت آغازگر تقریباً 60 درجه سانتیگراد است.با توجه به هدف آزمایش، پرایمرهایی با طول متوسط، ویژگی خوب و خود تکمیلی کمتر پرایمرها را برای آزمایش انتخاب کنید و درصد موفقیت بسیار بالاست!
04 تأیید ویژگی پرایمر
در واقع پرایمر بلاست علاوه بر طراحی پرایمرها می تواند پرایمرهایی را که خودمان طراحی کرده ایم نیز ارزیابی کند.به صفحه طراحی پرایمر برگردید، پرایمرهای بالادست و پایین دستی که طراحی کردیم را وارد کنید و سایر پارامترها تنظیم نمی شوند.پس از ارسال، می توانید ببینید که آیا این جفت پرایمر روی ژن های دیگر نیز وجود دارد یا خیر.اگر همه آنها روی ژنی که می‌خواهیم تقویت کنیم نشان داده شود، نشان می‌دهد که ویژگی این جفت پرایمر عالی است!(به عنوان مثال، این تنها نتیجه جستجوی آغازگر است!)

05 قضاوت کیفیت آغازگر
پرایمر "کامل" چه نوع آغازگری است که "بازده تقویت تا حد استاندارد"، "ویژگی های محصول تقویت شده" و "نتایج آزمایشی قابل اعتماد" را ترکیب می کند؟
راندمان تقویت

منحنی ذوب
راندمان تقویت پرایمرها به 90% -110% می رسد که به این معنی است که راندمان تقویت خوب است و منحنی ذوب دارای یک پیک منفرد و معمولا Tm> 80 درجه سانتیگراد است که به این معنی است که ویژگی تقویت خوب است.
 
محصولات مرتبط:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman