Real Time PCR که با نام‌های کمی PCR یا qPCR نیز شناخته می‌شود، روشی برای نظارت و آنالیز بلادرنگ محصولات تقویت PCR است.
از آنجایی که PCR کمی دارای مزایای عملکرد ساده، سریع و راحت، حساسیت بالا، تکرارپذیری خوب و میزان آلودگی کم است، به طور گسترده در آزمایش های پزشکی، ارزیابی اثربخشی دارو، تحقیقات بیان ژن، تحقیقات تراریخته، تشخیص ژن، تشخیص پاتوژن، تشخیص حیوانات و گیاهان استفاده می شود.، آزمایش مواد غذایی و سایر زمینه ها.
بنابراین، چه مشغول تحقیقات پایه در علوم زیستی باشید، چه کارمندان شرکت‌های دارویی، شرکت‌های دامپروری، شرکت‌های مواد غذایی و یا حتی کارکنان دفاتر بازرسی و قرنطینه ورودی و خروجی، بخش‌های نظارت محیطی، بیمارستان‌ها و سایر واحدها، کم و بیش در معرض آن قرار خواهید گرفت یا باید دانش تسلط بر روش کمی PCR را بدانید.

اصل Real Time PCR

Real Time PCR روشی است که در آن مواد فلورسنت به سیستم واکنش PCR اضافه می شود و شدت سیگنال فلورسانس در فرآیند واکنش PCR در زمان واقعی توسط دستگاه کمی PCR پایش می شود و در نهایت داده های تجربی مورد تجزیه و تحلیل و پردازش قرار می گیرند.

【منحنی تقویت】منحنی است که فرآیند پویا PCR را توصیف می کند.منحنی تقویت PCR در واقع یک منحنی نمایی استاندارد نیست، بلکه یک منحنی سیگموئید است.

[فاز پلت فرم منحنی تقویت]با افزایش تعداد چرخه های PCR، غیرفعال شدن DNA پلیمراز، کاهش dNTPs و پرایمرها و مهار واکنش سنتز توسط پیروفسفات محصول جانبی واکنش و غیره، PCR همیشه به صورت تصاعدی گسترش نمی یابد.، و در نهایت وارد یک فلات می شود.

[منطقه رشد نمایی منحنی تقویت]اگرچه فاز فلات بسیار متفاوت است، اما در ناحیه خاصی از ناحیه رشد نمایی منحنی تقویت، تکرارپذیری بسیار خوب است، که برای تجزیه و تحلیل کمی PCR بسیار مهم است.

[مقدار آستانه و مقدار Ct]ما مقدار حدی تشخیص فلورسانس را در موقعیت مناسب در ناحیه رشد نمایی منحنی تقویت، یعنی مقدار آستانه (آستانه) قرار می دهیم.محل تقاطع مقدار آستانه و منحنی تقویت، مقدار Ct است، یعنی مقدار Ct به تعداد چرخه ها (چرخه آستانه) هنگام رسیدن به مقدار آستانه اشاره دارد.

نمودار زیر به وضوح رابطه بین خط آستانه و منحنی تقویت، آستانه و مقدار Ct را نشان می دهد.

【چگونه کمیت کنیم؟】

با تئوری ریاضی ثابت شده است که مقدار Ct با لگاریتم تعداد الگوهای اولیه رابطه خطی معکوس دارد.Real Time PCR محصولات تقویت PCR را در زمان واقعی نظارت می کند و آنها را در مرحله تقویت نمایی کمیت می کند.

برای هر چرخه PCR، DNA به طور تصاعدی 2 برابر افزایش یافت و به زودی به یک فلات رسید.

با فرض اینکه مقدار DNA آغازین A باشد₀ ، پس از n چرخه، مقدار نظری محصول DNA را می توان به صورت زیر بیان کرد:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

سپس، هر چه مقدار DNA اولیه A 0 بیشتر باشد، مقدار محصول تقویت شده زودتر به مقدار تشخیص An می رسد و تعداد چرخه ها هنگام رسیدن به An مقدار Ct است.یعنی هر چه مقدار DNA اولیه A 0 بیشتر باشد، منحنی تقویت زودتر به اوج می رسد و به همین ترتیب تعداد چرخه های مورد نیاز n کوچکتر است.

ما رقت گرادیان استاندارد غلظت شناخته شده را انجام می دهیم و از آن به عنوان الگوی Real Time PCR استفاده می کنیم و یک سری منحنی تقویت در فواصل مساوی به ترتیب مقدار شروع DNA از بیشتر به کمتر بدست می آید.با توجه به رابطه خطی بین مقدار Ct و لگاریتم تعداد الگوهای شروع، یک[منحنی استاندارد] را می توان ایجاد کرد.

با جایگزینی مقدار Ct نمونه با غلظت ناشناخته به منحنی استاندارد می توان مقدار الگوی اولیه نمونه با غلظت نامشخص را بدست آورد که اصل کمی Real Time PCR است.

روش تشخیص Real Time PCR

Real Time PCR محصولات تقویت PCR را با تشخیص شدت فلورسانس در سیستم واکنش تشخیص می دهد.

اصل روش جاسازی رنگ فلورسنت】

رنگهای فلورسنتمانند TB Green®، می تواند به طور غیر اختصاصی به DNA دو رشته ای در سیستم های PCR متصل شود و پس از اتصال فلورسانس کند.

شدت فلورسانس در سیستم واکنش به طور تصاعدی با افزایش چرخه PCR افزایش یافت.با تشخیص شدت فلورسانس، میزان تقویت DNA در سیستم واکنش را می توان در زمان واقعی نظارت کرد و سپس مقدار الگوی شروع در نمونه را به طور معکوس تخمین زد.

【اصل روش پروب فلورسنت】

پروب فلورسنتیک توالی اسید نوکلئیک با یک گروه فلورسنت در انتهای '5 و یک گروه خاموش کننده در انتهای '3 است که می تواند به طور خاص به الگو متصل شود.هنگامی که پروب دست نخورده است، فلورسانس ساطع شده توسط فلوروفور توسط گروه خاموش کننده خاموش می شود و نمی تواند فلورسانس کند.هنگامی که پروب تجزیه می شود، ماده فلورسنت جدا شده و فلورسانس منتشر می کند.

یک پروب فلورسنت به محلول واکنش PCR اضافه می شود.در طول فرآیند بازپخت، پروب فلورسنت به موقعیت خاص قالب متصل می شود.در طول فرآیند گسترش، فعالیت اگزونوکلئاز 5'→3' آنزیم PCR می تواند پروب فلورسنت هیبرید شده با الگو را تجزیه کند و ماده فلورسنت برای انتشار فلورسانس تجزیه می شود.با تشخیص شدت فلورسانس پروب در سیستم واکنش، می توان به هدف نظارت بر میزان تقویت محصول PCR دست یافت.

【انتخاب روش تشخیص فلورسانس】

اگر از آن برای تشخیص توالی‌هایی با همسانی بالا و انجام تشخیص PCR Multiplex مانند آنالیز تایپ SNP استفاده شود، روش پروب فلورسنت غیر قابل جایگزینی است.
برای سایر آزمایش‌های Real Time PCR، می‌توان از یک روش کایمرا فلورسنت ساده، آسان و کم‌هزینه استفاده کرد.

probes ویژگی قوی، قادر به PCR Multiplex

کمبود

الزامات ویژگی بالا برای تقویت؛

PCR مالتی پلکس را نمی توان انجام داد نیاز به طراحی پروب های خاص، هزینه بالا.

گاهی اوقات طراحی پروب دشوار است

محصولات مرتبط: