RT-qPCR آزمایش اساسی زیست شناسی مولکولی است و همه باید با آن آشنا باشند.این عمدتا شامل سه مرحله است: استخراج RNA، رونویسی معکوس به cDNA، و PCR کمی فلورسنت بلادرنگ.کمکی نمی کند، چه خبر است؟به احتمال زیاد مشکلی وجود داردآزمایش رونویسی معکوس!اگرچه به نظر می رسد که آزمایش رونویسی معکوس فقط نیاز به افزودن RNA، dNTP، آغازگرها وترانس کریپتاز معکوسبه لوله سانتریفیوژ و به خوبی مخلوط کنید، اما در فرآیند عملیات واقعی، هنوز جزئیات زیادی وجود دارد که باید به آنها توجه شود.بیایید در مورد آن یاد بگیریم!

چگونه می توان کیفیت RNA را قضاوت کرد؟
برای به دست آوردن cDNA، کیفیت RNA حیاتی است!کیفیت RNA عمدتاً از دو جنبه قابل تشخیص است:
(1) یکپارچگی RNA:یکپارچگی RNA را می توان با الکتروفورز ژل آگارز تأیید کرد. با در نظر گرفتن یوکاریوت ها به عنوان مثال، RNA کل کامل دارای سه نوار شفاف است، وزن مولکولی از بزرگ به کوچک 28S، 18S و 5S است، و 28S دو برابر روشن تر از 18S است.اگر سه باند دیده می شود، اما نوع باند تار است یا Diffusion به این معنی است که RNA تا حدی تخریب شده است.در این زمان، لطفاً واکنش رونویسی معکوس را فوراً انجام دهید و ورودی الگو را به طور مناسب افزایش دهید.اگر فقط نواری با وزن مولکولی کوچک یا بدون نوار دیده شود، RNA کاملاً تخریب شده است و نیاز به استخراج مجدد دارد.Agilent 2100 یکپارچگی RNA را با نمودار پیک و مقدار RIN نشان می دهد.اگر اسید نوکلئیک دست نخورده باشد، خط پایه الکتروفروگرام صاف است.اگر اسید نوکلئیک به شدت تخریب شود، خط پایه ناهموار است و پیک های تخریب بیشتری ظاهر می شود.مقدار RIN منعکس کننده یکپارچگی RNA است، در محدوده 0-10، هر چه مقدار بزرگتر باشد، کیفیت RNA بهتر است.خوب، درجه کامل بودن بالاتر است.
(2) خلوص RNA:نسبت OD260/280 را می توان با اسپکتروفتومتری UV تشخیص داد.اگر نسبت OD260/280 بین 1.9 و 2.1 باشد، خلوص بسیار خوب است.
DNA ژنومی باقیمانده می تواند منجر به نتایج کمی نادرست شود
هنگامی که RNA استخراج می شود، RNAی که به دست می آوریم ممکن است با DNA ژنومی (gDNA) که پاکسازی نشده است مخلوط شود.بنابراین، cDNA پس از رونویسی معکوس نیز با آن مخلوط می شودgDNA.در طول پایین دستqPCRواکنش،cDNAو gDNA ممکن است به طور همزمان تقویت شوند و در نتیجه یک مقدار CT نسبتاً کوچک ایجاد شود، بنابراین نتایج ممکن است بایاس شوند.
پس در این شرایط باید چکار کنیم؟فورجینحاکی از:
(1) پاکسازی ژنوم را روی RNA معکوس انجام دهید، که می تواند با استخراج ستون در طول استخراج RNA حذف شود.
(2) RNA استخراج شده را با DNase درمان کنیدI ، اما آن را با EDTA خاتمه دهید.
معرف های رونویسی معکوسبا ماژول های پاکسازی ژنوم؛

چگونه پرایمرهایی را برای رونویسی معکوس انتخاب کنیم؟
آغازگرهای رونویسی معکوس نیز بر نتیجه واکنش رونویسی معکوس تأثیر می گذارد.با توجه به شرایط خاص آزمایش، می توانید آغازگرهای تصادفی، Oligo dT یا آغازگرهای اختصاصی ژن را برای رونویسی معکوس انتخاب کنید:
(1) رونوشت های خاص: آغازگرهای اختصاصی ژن توصیه می شود.
(2) رونوشت های قطعه طولانی: آغازگرهای اختصاصی الیگو dT/ژن توصیه می شود.
(3) قطعات داخلی رونوشت های بخش طولانی: پرایمرهای اختصاصی ژن/ پرایمرهای تصادفی / پرایمرهای تصادفی + Oligo dT.اگر آزمایش qPCR بعدی انجام شود، Oligo dT را نمی توان به تنهایی استفاده کرد، زیرا استفاده از Oligo dT به تنهایی ممکن است باعث بایاس انتهایی 3' شود که منجر به نتایج آزمایش qPCR نادرست می شود.
(4) miRNA: می توان از پرایمرهای حلقه ساقه یا باطله استفاده کرد.

چند بار باید cDNA محصول رونویسی معکوس برای تعیین کمیت رقیق شود؟
پس از به دست آوردن cDNA محصول رونویسی معکوس، چند بار cDNA باید برای آزمایش qPCR رقیق شود بسیار مهم است.اگر غلظت cDNA خیلی زیاد یا خیلی کم باشد، راندمان تقویت ممکن است تحت تأثیر قرار گیرد.آیا می توان غلظت cDNA را اندازه گیری کرد و چگونه باید این کار را انجام داد؟
(1) غلظت cDNA محصول رونویسی معکوس را نمی توان اندازه گیری کرد، زیرا علاوه بر محصول cDNA، محصول رونویسی معکوس همچنین حاوی بافر باقیمانده رونویسی معکوس، رونویسی معکوس، پرایمرها و غیره است که با نتایج اندازه گیری غلظت تداخل می کند و باعث می شود OD260/280، OD260/280، OD300، abnormal و OD200D را منعکس نمی کند.در این هنگام بعضی از دوستان می گویند بعد از تطهیر غلظت را اندازه می گیرم;در اینجا، Foregene می‌خواهد یادآوری کند که cDNA برای خالص‌سازی توصیه نمی‌شود، زیرا طول cDNA به‌دست‌آمده با برگشت متفاوت است و cDNA کوتاه در خالص‌سازی از بین می‌رود.
(2) پس چه باید کرد؟قبل از آزمایش qPCR، گرادیان رقت cDNA را می توان از طریق آزمایش قبلی تعیین کرد.به عنوان مثال: از محلول ذخیره cDNA، رقت 10 برابری و رقت 100 برابری به عنوان الگوهای آزمایش qPCR استفاده کنید و ضریب رقت را با مقدار CT در محدوده 18-28 انتخاب کنید.

چگونه miRNA ها باید رونویسی معکوس شوند؟
miRNA یک RNA مولکولی کوچک تک رشته ای با اندازه حدود 22 nt است که برای پروتئین کد نمی کند.روش qPCR معمولی به دلیل طول کوتاه آن، تعیین کمیت مستقیم آن دشوار است، بنابراین اغلب لازم است که miRNA را گسترش دهیم.روش‌های رونویسی معکوس معمولاً مورد استفاده برای miRNA شامل روش حلقه‌ای بنیادی و روش باطله است.
روش stem-loop گسترش miRNA با افزودن پرایمرهای حلقه ساقه است.این روش تشخیص حساسیت و ویژگی بالاتری دارد، اما توان تشخیص پایین است.یک رونویسی معکوس فقط می تواند یک miRNA و یک مرجع داخلی را شناسایی کند.روش دم افزودن از دو آن تشکیل شده است و با عمل مشترک دو آنزیم که پلیمراز PolyA و ترانس کریپتاز معکوس هستند تکمیل می شود.پلی مراز PolyA مسئول افزودن دم های PolyA به miRNA برای افزایش طول آن است و رونوشت معکوس واکنش رونویسی معکوس را انجام می دهد.این روش توان تشخیص بالایی دارد و می تواند miRNA های متعدد و مرجع داخلی را در یک رونویسی معکوس شناسایی کند، اما حساسیت و ویژگی در روش حلقه بنیادی پایین است.