همه در مورد اصل آزمایش qRT-PCR، طراحی پرایمر، تفسیر نتیجه و غیره صحبت می کنند، اما فکر می کنم باید عملکرد آزمایشی qRT-PCR را با شما در میان بگذارم.این کوچک است، اما در مورد نتایج است.

قبل از انجام qRT-PCR، باید درک روشنی از RNA و روش های عملیاتی خود داشته باشیم.به هر حال، تلاش ما به جای تمرین ساده، در جهت کسب نتیجه است.بنابراین قبل از انجام qRT-PCR، باید مسائل زیر را تعیین کنیم (برخی از آنها فقط برای SYBR قابل اجرا هستند).

1 آیا مطمئن هستید که RNA شما تجزیه نشده است؟

NanoDrop 2000 تنها می تواند غلظت و خلوص RNA را تشخیص دهد، اما نمی تواند یکپارچگی RNA را تشخیص دهد.

مقدار RNA (RNA Intesity Number) می تواند یکپارچگی RNA را منعکس کند که توسط سیستم Bioanalyzer Agilent 2100 شناسایی می شود.

شکل نمودار شماتیک مقادیر RIN برای نمونه های مختلف RNA (یوکاریوت ها)

با این حال، آزمایشگاه ها به طور کلی دارای Agilent 2100 Bioanalyzer نیستند.در این حالت می‌توانیم از طریق ژل فرمالدئید تشخیص دهیم، اما نیاز به مقدار کل RNA زیاد است، بنابراین سریع‌ترین روش استفاده از الکتروفورز ژل معمولی است.لازم است در محیطی عاری از هسته باشد، بنابراین لازم است مخزن الکتروفورز، بطری محلول، براکت ژل و شانه با آب DEPC شسته شود.آگارز همچنین بدون نوکلئاز است (تا زمانی که تازه باز شده باشد)، و بافر بارگیری باید تا حد امکان با ژل 1.2٪ تازه باز شود.

توجه داشته باشید که ژل باید کاملا حل شود در غیر این صورت مانند نمونه 9 در شکل باعث ایجاد نوارهای ناهمگن می شود.اگر ولتاژ بیش از حد بالا باشد یا برای مدت طولانی کار کند، گرما تولید می کند و باعث تخریب RNA می شود، بنابراین ولتاژ و زمان باید به طور منطقی کنترل شود.علاوه بر این، اجرای ژل می‌تواند بیشتر تعیین کند که آیا بقایای DNA در نمونه وجود دارد یا خیر، و مشاهده کند که آیا تعداد زیادی نوار باقی مانده در چاه توزیع وجود دارد یا خیر.

شکل.تشخیص ژل الکتروفورز RNA

2 آیا از غلظت cDNA خود مطمئن هستید؟

تجربه برادران بزرگ در آزمایشگاه این است که cDNA سیستم 20 ul که با هر وارونگی به دست می‌آید مستقیماً 20 برابر رقیق می‌شود، در حالی که خواهران فوق دکترا 10 برابر رقیق می‌شوند.من معمولا به موقعیت بستگی دارم.از آنجایی که کیفیت RNA ذکر شده توسط هر فرد متفاوت است، سطح برگشت نیز متفاوت است و ممکن است فناوری معکوس پایدار نباشد.

بنابراین هر بار که cDNA معکوس را دریافت می کنم، ابتدا آن را حدود 3 بار رقیق می کنم و سپس از ژن خانه داری برای انجام RT-PCR استفاده می کنم، تعداد چرخه ها به طور کلی 25 سیکل است تا غلظت خاص را شناسایی کنم و سپس فاکتور رقت نهایی را تعیین کنم.

3 آیا مطمئن هستید که استفاده از پرایمرهای شما آسان است؟

می تواند منحنی ذوب qRT-PCR را پشت سر بگذارد، اما این هنوز هزینه دارد.برای آزمایشگاه‌هایی که هزینه زیادی ندارند، وقتی پرایمرهای زیادی دریافت می‌کنند، می‌توانند از RT-PCR معمولی استفاده کنند تا ببینند که آیا یک باند است یا خیر و ویژگی پرایمرها را شناسایی کنند.اگر آزمایشگاه کمبود بودجه نداشته باشد، ویژگی همه پرایمرها یک بار از طریق منحنی ذوب قابل تشخیص است.

4 آیا مطمئن هستید که شرایط آزمایشی شما مناسب است؟

SYBR باید از نور شدید محافظت شود، بنابراین سعی کنید هنگام اضافه کردن معرف SYBR، نور بالای سر را خاموش کنید و فقط برای تکمیل آن باید از نور کم استفاده کنید.

SYBR را در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری کنید.هنگام استفاده، به آرامی به سمت بالا و پایین برگردانید تا به خوبی مخلوط شود تا کف نشود و به شدت گردابی نکنید.

برخی از خواهران کوچکتر دوست دارند از ترس اختلاط نمونه ها روی برد PCR علامت بگذارند، که اشتباه است.از آنجایی که نشانگرهای شما به احتمال زیاد بر مجموعه سیگنال‌های فلورسنت تأثیر می‌گذارند، من معمولاً به نوجوانان توصیه می‌کنم از نوت‌بوک‌های آزمایشی برای کمک به حافظه استفاده کنند، همانطور که در زیر نشان داده شده است.

شکل.نمودار بارگذاری نمونه qRT-PCR

5 آیا مطمئن هستید که آن را درست انجام می دهید؟

حتما دستکش بپوشید، دستکش بپوشید، دستکش بپوشید و چیزهای مهم را سه بار بگویید.

به منظور کاهش قرار گرفتن در معرض نور SYBR، من شخصاً دوست دارم ابتدا یک الگو اضافه کنم، همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است.با توجه به تجربه، افزودن مقدار کمی از الگو احتمالا باعث خطاهای نمونه گیری می شود.بنابراین، برای به حداقل رساندن خطای ناشی از افزودن مقدار کمی الگو، معمولاً نمونه را دوباره دو برابر می‌کنم و هنگام افزودن نمونه، مقدار آن را دو برابر می‌کنم تا مقدار H2O2 اضافه شده کاهش یابد.

شکل.نمودار شماتیک بارگذاری qRT-PCR

سپس سیستم qRT-PCR را به صورت زیر پیکربندی کنید.

شکل.نمودار آماده سازی سیستم qRT-PCR

توجه: فرآیند پیکربندی باید روی یخ انجام شود.

پس از افزودن نمونه، فیلم آب بندی شفاف را بچسبانید.سعی کنید سطح فیلم درزگیر شفاف را با دستان خود لمس نکنید، فقط از فضای دو طرف فیلم کار کنید.زیرا اثر انگشت ممکن است بر روی مجموعه سیگنال های فلورسنت نیز تاثیر بگذارد.سپس از یک سانتریفیوژ برای سانتریفیوژ سریع به مدت 10 ثانیه با سرعت کم استفاده کنید تا از آویزان شدن نمونه روی دیوار جلوگیری شود.

محصولات مرتبط:

کیت Cell Direct RT-qPCR

RT Easy II