اساس طراحی پرایمر (99٪ مشکلات قابل حل است)

1. طول پرایمر: کتاب درسی به 15-30 جفت باز نیاز دارد، معمولاً حدود 20 جفت باز.شرایط واقعی بهتر است 18-24 جفت باز باشد تا از ویژگی اطمینان حاصل شود، اما هر چه طولانی تر بهتر باشد، پرایمر بیش از حد طولانی نیز ویژگی را کاهش می دهد و بازده را کاهش می دهد.

2. گستره تقویت پرایمر: 200-500 جفت باز مناسب است و قطعه را می توان تحت شرایط خاص تا 10 کیلوبایت افزایش داد.

3. پایه پرایمر: محتوای G+C باید 40-60% باشد، اثر تقویت خیلی کم G+C خوب نیست، G+C زیاد به راحتی باندهای غیر اختصاصی به نظر می رسد.ATGC بهتر است به صورت تصادفی توزیع شود و از خوشه های بیش از 5 نوکلئوتید پورین یا پیریمیدین اجتناب شود.Multi-gc برای انتهای 5' و دنباله های میانی برای افزایش پایداری، از GC غنی در انتهای 3'، بدون GC برای 3 پایه آخر، یا عدم GC برای 3 از 5 پایه آخر اجتناب کنید.

4. از ساختار ثانویه در پرایمرها خودداری کنید و از تکمیل شدن بین دو پرایمر به خصوص مکمل در انتهای 3 پرهیز کنید، در غیر این صورت دایمر پرایمر تشکیل می شود و نوارهای تقویت شده غیر اختصاصی ایجاد می شود.

5. بازهای انتهای 3 پرایمرها، به ویژه پایه های آخر و ماقبل آخر، باید به شدت جفت شوند تا از شکست PCR به دلیل جفت نشدن پایه های ترمینال جلوگیری شود.

6. پرایمرها دارای مکان های برش مناسب هستند یا می توان آنها را اضافه کرد و توالی هدف تقویت شده ترجیحاً باید دارای مکان های برش مناسب باشد که برای تجزیه و تحلیل برش یا شبیه سازی مولکولی بسیار مفید است.

7. ویژگی پرایمرها: پرایمرها نباید همسانی آشکاری با سایر توالی ها در پایگاه داده توالی اسید نوکلئیک داشته باشند.

8. آموزش استفاده از نرم افزار: PP5، Oligo6، DNAstar، Vector NTI، primer3 (این طراحی آنلاین بهترین کار را دارد).

محتوای فوق می تواند حداقل 99 درصد از مشکلات طراحی پرایمر را حل کند.

جزئیات طراحی پرایمر را کنترل کنید

1. طول پرایمر

طول پرایمر عمومی 18 تا 30 پایه است.به طور کلی مهمترین عامل تعیین کننده دمای بازپخت پرایمر طول پرایمر است.دمای بازپخت پرایمر به طور کلی انتخاب می شود (مقدار Tm -5 ℃)، و برخی به طور مستقیم از مقدار Tm استفاده می کنند.از فرمول های زیر می توان برای محاسبه تقریباً دمای بازپخت پرایمرها استفاده کرد.

زمانی که طول پرایمر کمتر از 20 جفت باز باشد: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

هنگامی که طول پرایمر بیشتر از 20 جفت باز است: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) - 500 / طول - 5 ℃

علاوه بر این، بسیاری از نرم افزارها نیز می توانند برای محاسبه دمای بازپخت استفاده شوند، اصل محاسبه متفاوت خواهد بود، بنابراین گاهی اوقات مقدار محاسبه شده ممکن است شکاف کمی داشته باشد.برای بهینه‌سازی واکنش‌های PCR، کوتاه‌ترین پرایمرهایی که دمای بازپخت حداقل 54 درجه سانتیگراد را تضمین می‌کنند، برای بهترین کارایی و ویژگی استفاده می‌شوند.

به طور کلی، ویژگی پرایمر برای هر نوکلئوتید اضافی چهار برابر افزایش می یابد، به طوری که حداقل طول آغازگر برای اکثر کاربردها 18 نوکلئوتید است.حد بالایی طول پرایمر خیلی مهم نیست، عمدتاً مربوط به راندمان واکنش است.به دلیل آنتروپی، هرچه پرایمر طولانی‌تر باشد، سرعت آنیل شدن آن برای اتصال به DNA هدف برای تشکیل یک الگوی دو رشته‌ای پایدار برای اتصال DNA پلیمراز کمتر می‌شود.

هنگام استفاده از نرم افزار برای طراحی پرایمرها، طول پرایمرها را می توان به نوبه خود با مقدار TM تعیین کرد، به ویژه برای پرایمرهای فلورسانس کمی PCR، TM=60℃ یا بیشتر باید کنترل شود.

2. محتوای GC

به طور کلی، محتوای G+C در توالی های پرایمر 40٪ تا 60٪ است و محتوای GC و مقدار Tm یک جفت پرایمر باید هماهنگ باشند.اگر پرایمر تمایل جدی به GC یا AT داشته باشد، مقدار مناسبی از A، T یا G و C دم را می توان به انتهای 5' پرایمر اضافه کرد.

3. دمای بازپخت

دمای بازپخت باید 5 درجه کمتر از دمای زنجیر باز شود.اگر تعداد پایه های پرایمر کم باشد، دمای بازپخت را می توان به طور مناسب افزایش داد که می تواند ویژگی PCR را افزایش دهد.اگر تعداد پایه ها زیاد باشد، دمای بازپخت را می توان به طور مناسب کاهش داد.تفاوت دمای بازپخت بین یک جفت پرایمر 4 ~ 6 ℃ بر بازده PCR تأثیر نمی گذارد، اما در حالت ایده آل دمای بازپخت یک جفت پرایمر یکسان است که می تواند بین 55 ~ 75 درجه سانتیگراد متغیر باشد.

4. از ناحیه ساختار ثانویه الگوی تقویت اجتناب کنید

هنگام انتخاب قطعه تقویت شده بهتر است از ناحیه ساختار ثانویه الگو خودداری کنید.ساختار ثانویه پایدار قطعه هدف را می توان توسط نرم افزار کامپیوتری مربوطه پیش بینی و تخمین زد که برای انتخاب الگو مفید است.نتایج تجربی نشان می‌دهد که انبساط اغلب زمانی ناموفق است که انرژی آزاد (△G) ناحیه مورد انبساط کمتر از 58.6 lkJ/mol باشد.

5. عدم تطابق با DNA هدف

هنگامی که توالی DNA هدف تقویت شده بزرگ باشد، ممکن است یک پرایمر به چندین بخش از DNA هدف متصل شود و در نتیجه نوارهای متعددی در نتیجه ظاهر شود.این بار لازم است از وب سایت تست نرم افزار BLAST استفاده کنید:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Align two sequences (bl2seq) را انتخاب کنید.

چسباندن توالی های پرایمر به منطقه 1 و توالی های DNA هدف به منطقه 2 قابل تعویض است و BLAST احتمالات مکمل، آنتی سنس و سایر موارد را محاسبه می کند، بنابراین کاربران نیازی به توجه ندارند که آیا هر دو زنجیره زنجیره های حسی هستند یا خیر.همچنین اگر شماره GI دنباله را در پایگاه داده می دانید، می توانید شماره GI را وارد کنید، بنابراین لازم نیست بخش بزرگی از دنباله را بچسبانید.در نهایت، روی Align at 3 کلیک کنید تا ببینید آیا پرایمر دارای چندین سایت همولوگ در DNA هدف است یا خیر.

6. ترمینال پرایمر

انتهای 3 پرایمر جایی است که پسوند شروع می شود، بنابراین مهم است که از شروع عدم تطابق در آنجا جلوگیری کنید.انتهای 3 نباید بیشتر از 3 G یا C متوالی باشد، زیرا این باعث می شود که پرایمر به اشتباه در ناحیه توالی غنی سازی G+C فعال شود.انتهای 3 نمی تواند هیچ ساختار ثانویه ای ایجاد کند، به جز در واکنش های خاص PCR (AS-PCR)، انتهای 3 پرایمر نمی تواند ناهماهنگ باشد.به عنوان مثال، اگر ناحیه کد کننده تقویت شود، انتهای 3 پرایمر نباید در موقعیت سوم کدون خاتمه یابد، زیرا موقعیت سوم کدون مستعد انحطاط است که بر ویژگی و کارایی تقویت تأثیر می گذارد.هنگام استفاده از پرایمرهای الحاقی، به جدول استفاده از کدون مراجعه کنید، به اولویت بیولوژیکی توجه کنید، از پرایمرهای الحاقی در انتهای 3' استفاده نکنید و از پرایمرهای با غلظت بالاتر (1uM-3uM) استفاده کنید.

7. ساختار ثانویه آغازگرها

خود پرایمرها نباید دارای توالی های مکمل باشند، در غیر این صورت خود پرایمرها به ساختارهای سنجاق سر تا می شوند و این ساختار ثانویه به دلیل مانع فضایی بر اتصال پرایمرها و قالب ها تأثیر می گذارد.در صورت استفاده از قضاوت مصنوعی، پایه های مکمل پیوسته خود پرایمرها نباید بیشتر از 3bp باشد.نباید هیچ مکملی بین دو پرایمر وجود داشته باشد، به ویژه از همپوشانی مکمل انتهای 3 برای جلوگیری از تشکیل دایمرهای آغازگر باید اجتناب شود.به طور کلی، بین یک جفت آغازگر نباید بیش از 4 همولوژی یا مکمل بودن پایه متوالی وجود داشته باشد.

8. نشانگرها یا جایگاه ها را اضافه کنید

انتهای 5 تأثیر کمی بر ویژگی تقویت دارد و بنابراین می تواند بدون تأثیر بر ویژگی تقویت اصلاح شود.اصلاح پرایمر 5 'پایان شامل: اضافه کردن سایت محدودیت آنزیم.بیوتین نشاندار، فلورسانس، دیگوکسین، Eu3+، و غیره. معرفی توالی DNA اتصال دهنده به پروتئین.معرفی مکان های جهش، درج و از دست دادن توالی های جهش و معرفی توالی های پروموتر و .... بازهای اضافی کم و بیش بر راندمان تقویت و افزایش احتمال تشکیل دایمرهای پرایمر تأثیر می گذارد، اما برای مرحله بعدی باید کمی اغماض کرد.توالی‌های اضافی که در توالی هدف وجود ندارند، مانند مکان‌های محدودکننده و توالی‌های پروموتر، می‌توانند بدون تأثیر بر ویژگی به انتهای 5' پرایمر اضافه شوند.این توالی ها در محاسبه مقادیر Tm پرایمر گنجانده نشده اند، اما باید از نظر مکمل بودن و ساختار ثانویه داخلی آزمایش شوند.

9. ساب کلون ها

در بیشتر مواقع، PCR فقط شبیه سازی اولیه است و سپس باید قطعه هدف را در ناقل های مختلف سابکلون کنیم، بنابراین باید پایه های اضافی برای عملیات بعدی در مرحله PCR طراحی کنیم.

برخی از توالی های طراحی شده برای ساب کلونینگ در زیر خلاصه شده است.
سایت محدود کننده اندونوکلئاز اضافه شد

افزودن مکان های محدود کننده آنزیمی رایج ترین روش مورد استفاده برای ساب کلونینگ محصولات PCR است.به طور کلی، محل برش شش پایه است، علاوه بر 5 'پایان محل رخ نیاز به اضافه کردن 2 ~ 3 پایه محافظ است.با این حال، تعداد بازهای محافظ مورد نیاز آنزیم های مختلف متفاوت است.برای مثال، SalⅠ به هیچ پایه محافظ، EcoRⅤ به 1 پایه محافظ، NotⅠ به 2 پایه محافظ، و Hind Ⅲ به 3 پایه محافظ نیاز ندارد.

LIC دم را اضافه می کند

نام کامل LIC کلونینگ مستقل از بستن است، یک روش شبیه سازی که توسط ناووژن به طور خاص برای بخشی از وکتور pET ابداع شده است.حامل pET تهیه شده به روش LIC دارای انتهای چسبنده تک رشته ای 12-15 پایه غیر مکمل است که مکمل انتهای چسبنده مربوطه بر روی قطعه درج هدف است.برای اهداف تقویت، دنباله آغازگر 5 این قطعه درج شده باید بردار LIC را تکمیل کند.فعالیت اکسترنتکت 3'→5' DNA پلیمراز T4 می تواند پس از مدت کوتاهی یک انتهای چسبنده تک رشته ای را روی قطعه درج شده تشکیل دهد.از آنجایی که محصول فقط از بازپخت متقابل قطعه درج تهیه شده و وکتور می‌توان به وجود آمد، این روش بسیار سریع و کارآمد است و شبیه‌سازی مستقیم است.
کلون TA هدایت شده اضافه کردن دم
شبیه سازی TA قادر به هدف قرار دادن قطعه به یک ناقل نبود، بنابراین بعداً Invitrogen ناقلی را معرفی کرد که می توانست شبیه سازی را هدف قرار دهد که حاوی چهار پایه برجسته GTGGS در یک انتها بود.بنابراین، در طراحی پرایمرهای PCR، باید توالی‌های مکمل را بر این اساس اضافه کرد تا بتوان قطعات را «جهت‌یابی» کرد.

اگر وقتتان کم است، می توانید سنتز مستقیم را امتحان کنید، ژن را با ناقل ترکیب کنید، چیزی که ما در عضلانی ها سنتز ژن ET می نامیم.

د. روش کلونینگ In-Fusion

نیازی به لیگاز نیست، نیازی به واکنش طولانی نیست.تا زمانی که در طراحی پرایمرها، توالی در هر دو انتهای وکتور خطی شده معرفی شود، سپس محصول PCR و وکتور خطی شده به محلول آنزیم اینفیوژن حاوی BSA اضافه شده و به مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار داده شود، می توان تبدیل را انجام داد.این روش به ویژه برای تبدیل حجم زیاد مناسب است.

10. پرایمر را ادغام کنید

گاهی اوقات، فقط اطلاعات توالی محدودی در مورد طراحی پرایمر شناخته شده است.به عنوان مثال، اگر فقط توالی اسید آمینه شناخته شده باشد، می توان آغازگر ادغام را طراحی کرد.پرایمر ادغامی مخلوطی از توالی های مختلف است که نمایانگر همه احتمالات پایه مختلف است که یک اسید آمینه واحد را کد می کند.برای افزایش ویژگی، می توانید به جدول استفاده از کدون برای کاهش الحاق با توجه به ترجیحات استفاده پایه ارگانیسم های مختلف مراجعه کنید.هیپوگزانتین را می توان با تمام پایه ها جفت کرد تا دمای بازپخت پرایمر کاهش یابد.از پایه های پیوست شده در انتهای 3 پرایمر استفاده نکنید زیرا بازپخت 3 پایه آخر در انتهای 3 دقیقه برای شروع PCR در محل اشتباه کافی است.غلظت های پرایمر بالاتر (1μM تا 3μM) استفاده می شود زیرا آغازگرها در بسیاری از مخلوط های الحاقی برای الگوی هدف خاص نیستند.

مواد اولیه PCRکنترل

1. مقدار پرایمر

غلظت هر پرایمر 0.1 ~ 1umol یا 10 ~ 100pmol است.بهتر است با کمترین مقدار پرایمر نتیجه مورد نیاز را ایجاد کنید.غلظت بالای پرایمر باعث عدم تطابق و تقویت غیر اختصاصی می شود و احتمال تشکیل دایمر بین پرایمرها را افزایش می دهد.

2. غلظت پرایمر

غلظت پرایمرها بر ویژگی تأثیر می گذارد.غلظت بهینه پرایمر به طور کلی بین 0.1 تا 0.5 میکرومولار است.غلظت پرایمر بالاتر منجر به تقویت محصولات غیر اختصاصی می شود.

3. دمای بازپخت پرایمر

پارامتر مهم دیگر برای پرایمرها دمای ذوب (Tm) است.این دمایی است که 50 درصد از آغازگرها و توالی های مکمل به صورت مولکول های DNA دو رشته ای نشان داده می شوند.Tm برای تنظیم دمای آنیل PCR مورد نیاز است.در حالت ایده آل، دمای بازپخت به اندازه کافی پایین است تا از بازپخت موثر پرایمرها با توالی هدف اطمینان حاصل شود، اما به اندازه کافی بالا است تا اتصال غیر اختصاصی را کاهش دهد.دمای بازپخت معقول از 55 ℃ تا 70 ℃.دمای بازپخت معمولاً 5 درجه کمتر از Tm پرایمر تنظیم می شود.

چندین فرمول برای تنظیم Tm وجود دارد که بسته به فرمول مورد استفاده و ترتیب پرایمرها بسیار متفاوت است.از آنجایی که اکثر فرمول‌ها مقدار تخمینی Tm را ارائه می‌کنند، تمام دماهای بازپخت تنها یک نقطه شروع هستند.ویژگی را می توان با تجزیه و تحلیل چندین واکنش که به تدریج دمای بازپخت را افزایش می دهد، بهبود بخشید.زیر دمای تخمینی Tm-5 ℃ شروع کنید و به تدریج دمای بازپخت را با افزایش 2 درجه افزایش دهید.دمای بازپخت بالاتر باعث کاهش تشکیل دیمرهای پرایمر و محصولات غیر اختصاصی می شود.برای بهترین نتایج، دو پرایمر باید مقادیر تقریبی Tm داشته باشند.اگر اختلاف Tm جفت پرایمر بیشتر از 5 درجه باشد، پرایمرها با استفاده از دمای بازپخت پایین تر در چرخه شروع نادرست قابل توجهی نشان می دهند.اگر دو پرایمر Tm متفاوت هستند، دمای بازپخت را 5 درجه کمتر از کمترین Tm تنظیم کنید.روش دیگر، برای افزایش ویژگی، پنج چرخه را می توان ابتدا در دماهای بازپخت طراحی شده برای Tm بالاتر انجام داد، سپس چرخه های باقیمانده در دماهای بازپخت برای Tm کمتر طراحی شده است.این اجازه می دهد تا یک کپی جزئی از الگوی مقصد در شرایط سخت به دست آید.

4. خلوص و پایداری پرایمر

خلوص استاندارد پرایمرهای سفارشی برای اکثر کاربردهای PCR کافی است.حذف گروه های بنزوئیل و ایزوبوتیلیل با نمک زدایی حداقل است و بنابراین با PCR تداخلی ایجاد نمی کند.برخی از برنامه ها برای حذف هر گونه توالی غیر تمام طول در فرآیند سنتز نیاز به تصفیه دارند.این توالی های کوتاه شده به این دلیل رخ می دهند که کارایی شیمی سنتز DNA 100٪ نیست.این یک فرآیند دایره‌ای است که از واکنش‌های شیمیایی مکرر استفاده می‌کند، زیرا هر باز برای ایجاد DNA از 3' تا 5' اضافه می‌شود.شما می توانید در هر دو چرخه شکست بخورید.آغازگرهای بلندتر، به ویژه آنهایی که بیش از 50 باز دارند، نسبت زیادی از توالی های کوتاه دارند و ممکن است نیاز به خالص سازی داشته باشند.

بازده پرایمرها تحت تأثیر کارایی شیمی مصنوعی و روش خالص سازی است.شرکت‌های بیوداروسازی، مانند سیتولوژی و Shengong، همگی از حداقل واحد OD برای اطمینان از خروجی کلی الیگونوکلئوزید استفاده می‌کنند.پرایمرهای سفارشی به صورت پودر خشک ارسال می شوند.بهتر است پرایمرها را مجدداً در TE حل کنید تا غلظت نهایی 100 میکرومولار باشد.TE بهتر از آب دیونیزه است زیرا pH آب اغلب اسیدی است و باعث هیدرولیز الیگونوکلئوزیدها می شود.

پایداری پرایمرها به شرایط نگهداری بستگی دارد.پودر خشک و پرایمرهای محلول باید در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شوند.پرایمرهای حل شده در TE در غلظت‌های بیشتر از 10 میکرومولار می‌توانند به‌مدت 6 ماه در دمای -20 درجه سانتیگراد به‌طور پایدار نگهداری شوند، اما فقط می‌توانند در دمای اتاق (15 تا 30 درجه سانتیگراد) برای کمتر از 1 هفته نگهداری شوند.پرایمرهای پودر خشک را می توان در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت حداقل 1 سال و در دمای اتاق (15 تا 30 درجه سانتی گراد) تا 2 ماه نگهداری کرد.

5. آنزیم ها و غلظت آنها

در حال حاضر، Taq DNA پلیمراز مورد استفاده اساساً آنزیم مهندسی ژن است که توسط باکتری های کلیفرم سنتز می شود.مقدار آنزیم مورد نیاز برای کاتالیز یک واکنش PCR معمولی حدود 2.5U است (به حجم کل واکنش 100 ul اشاره دارد).اگر غلظت خیلی زیاد باشد، می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی شود.اگر غلظت خیلی کم باشد، مقدار محصول مصنوعی کاهش می یابد.

6. کیفیت و غلظت dNTP

کیفیت dNTP ارتباط نزدیکی با غلظت و کارایی تقویت PCR دارد.پودر dNTP دانه ای است و تنوع آن در صورت نگهداری نادرست فعالیت بیولوژیکی خود را از دست می دهد.محلول dNTP اسیدی است و باید در غلظت بالا، با محلول بافر 1M NaOH یا 1M Tris.HCL برای تنظیم PH آن به 7.0 ~ 7.5، مقدار کمی بسته بندی فرعی، ذخیره سازی منجمد در -20 درجه سانتیگراد استفاده شود.انجماد-ذوب چندگانه باعث تخریب dNTP می شود.در واکنش PCR، dNTP باید 50 ~ 200umol/L باشد.به خصوص باید توجه داشت که غلظت چهار DNTPS باید برابر باشد (آماده سازی مول برابر).اگر غلظت هر یک از آنها با بقیه متفاوت باشد (بیشتر یا کمتر)، عدم تطابق ایجاد می شود.غلظت خیلی کم باعث کاهش بازده محصولات PCR می شود.dNTP می تواند با Mg2+ ترکیب شود و غلظت Mg2+ آزاد را کاهش دهد.

7. الگو (ژن هدف) اسید نوکلئیک

مقدار و درجه خالص سازی اسید نوکلئیک الگو یکی از لینک های کلیدی برای موفقیت یا شکست PCR است.روش‌های سنتی خالص‌سازی DNA معمولاً از SDS و پروتئاز K برای هضم و دفع نمونه‌ها استفاده می‌کنند.عملکردهای اصلی SDS عبارتند از: حل کردن لیپیدها و پروتئین ها در غشای سلولی، در نتیجه از بین بردن غشای سلولی با حل کردن پروتئین های غشایی، و تجزیه پروتئین های هسته ای در سلول، SDS همچنین می تواند با پروتئین ها ترکیب شود و رسوب کند.پروتئاز K می تواند پروتئین ها، به ویژه هیستون های متصل به DNA را هیدرولیز و هضم کند و سپس از فنل و کلروفرم حلال آلی برای استخراج پروتئین ها و سایر اجزای سلولی و استفاده از اتانول یا ایزوپروپیل الکل برای رسوب اسید نوکلئیک استفاده کند.اسید نوکلئیک استخراج شده می تواند به عنوان یک الگو برای واکنش های PCR استفاده شود.برای نمونه‌های تشخیص کلینیکی عمومی، می‌توان از یک روش سریع و ساده برای حل کردن سلول‌ها، لیز کردن پاتوژن‌ها، هضم و حذف پروتئین‌ها از کروموزوم‌ها به ژن‌های هدف آزاد و مستقیماً برای تقویت PCR استفاده کرد.استخراج الگوی RNA معمولاً از روش ایزوتیوسیانات گوانیدین یا پروتئاز K برای جلوگیری از تجزیه RNase از RNA استفاده می کند.

غلظت 8.Mg2+

Mg2+ تأثیر قابل توجهی بر ویژگی و بازده تکثیر PCR دارد.در واکنش کلی PCR، زمانی که غلظت dNTP های مختلف 200 umol/L باشد، غلظت مناسب Mg2+ 1.5 ~ 2.0mmol/L است.غلظت Mg2+ خیلی زیاد است، ویژگی واکنش کاهش می یابد، تقویت غیر اختصاصی رخ می دهد، غلظت بسیار کم باعث کاهش فعالیت Taq DNA پلیمراز می شود و در نتیجه محصولات واکنش کاهش می یابد.

یون‌های منیزیم بر چندین جنبه از PCR تأثیر می‌گذارند، مانند فعالیت DNA پلیمراز، که بر عملکرد تأثیر می‌گذارد.مثال دیگر آنیلینگ پرایمر است که بر ویژگی تأثیر می گذارد.dNTP و الگو به یون منیزیم متصل می شوند و مقدار یون منیزیم آزاد مورد نیاز برای فعالیت آنزیم را کاهش می دهند.غلظت بهینه یون منیزیم برای جفت‌ها و قالب‌های مختلف پرایمر متفاوت است، اما غلظت اولیه PCR معمولی با dNTP 200 میکرومولار 1.5 میلی‌مولار است (توجه داشته باشید: برای PCR کمی بلادرنگ، از محلول یون منیزیم 3 تا 5 میلی‌مولار با پروب فلورسنت استفاده کنید).غلظت‌های بالاتر یون‌های آزاد منیزیم باعث افزایش بازده می‌شود، اما تقویت غیر اختصاصی را افزایش می‌دهد و وفاداری را کاهش می‌دهد.برای تعیین غلظت بهینه، تیتراسیون یون منیزیم با افزایش 0.5 میلی‌مولار از 1 میلی‌مولار به 3 میلی‌مولار انجام شد.برای کاهش وابستگی به بهینه سازی یون منیزیم، می توان از پلاتین Taq DNA پلیمراز استفاده کرد.پلاتین Taq DNA پلیمراز قادر به حفظ عملکرد در محدوده وسیع تری از غلظت یون منیزیم نسبت به Taq DNA پلیمراز است و بنابراین به بهینه سازی کمتری نیاز دارد.

9. افزودنی های ترویج کننده Pcr

بهینه سازی دمای بازپخت، طراحی پرایمر و غلظت یون منیزیم برای تقویت بسیار ویژه بیشتر قالب ها کافی است.با این حال، برخی از الگوها، از جمله آنهایی که محتوای GC بالایی دارند، به اقدامات اضافی نیاز دارند.افزودنی هایی که بر دمای ذوب DNA تأثیر می گذارند، راه دیگری برای بهبود ویژگی و عملکرد محصول ارائه می دهند.دناتوره کردن کامل قالب برای بهترین نتایج مورد نیاز است.

علاوه بر این، ساختار ثانویه از اتصال پرایمر و گسترش آنزیم جلوگیری می کند.

افزودنی های PCR، از جمله فرمید، DMSO، گلیسیرین، بتائین و محلول تقویت کننده PCRx، تقویت را افزایش می دهند.مکانیسم احتمالی آنها کاهش دمای ذوب است، بنابراین به بازپخت پرایمرها و کمک به گسترش DNA پلیمراز از طریق ناحیه ساختار ثانویه کمک می کند.محلول PCRx مزایای دیگری نیز دارد.حداقل بهینه سازی یون منیزیم هنگام استفاده با پلاتینوم Taq DNA پلیمراز و Platinum Pfx DNA پلیمراز مورد نیاز است.بنابراین، تکنیک پلاتین با افزودنی ترکیب می‌شود تا ویژگی را افزایش دهد و در عین حال وابستگی رویکرد سوم یعنی بهینه‌سازی یون منیزیم را کاهش دهد.برای بهترین نتایج، غلظت مواد افزودنی باید بهینه شود، به ویژه DMSO، فرمامید و گلیسرول، که Taq DNA پلیمراز را مهار می کنند.

 Foreasy Taq DNA Polymerase

10. شروع داغ

Hot start PCR یکی از مهم ترین روش ها برای بهبود ویژگی PCR علاوه بر طراحی پرایمر خوب است.اگرچه دمای بهینه ازدیاد طول تاق DNA پلیمراز 72 درجه سانتیگراد است، پلیمراز در دمای اتاق فعال باقی می ماند.بنابراین، محصولات غیر اختصاصی زمانی تولید می شوند که دمای نگهداری کمتر از دمای بازپخت در طول آماده سازی واکنش PCR و در آغاز چرخه حرارتی باشد.پس از تشکیل، این محصولات غیر اختصاصی به طور موثر تقویت می شوند.PCR با شروع داغ مخصوصاً زمانی مؤثر است که مکان‌های مورد استفاده برای طراحی پرایمر توسط مکان عناصر ژنتیکی محدود شوند، مانند جهش‌های هدایت‌شده به مکان، شبیه‌سازی بیان، یا ساخت و دستکاری عناصر ژنتیکی مورد استفاده برای مهندسی DNA.

یک روش معمول برای محدود کردن فعالیت Taq DNA پلیمراز، تهیه محلول واکنش PCR روی یخ و قرار دادن آن در دستگاه PCR از قبل گرم شده است.این روش ساده و ارزان است، اما فعالیت آنزیم را کامل نمی کند و بنابراین تقویت محصولات غیر اختصاصی را به طور کامل حذف نمی کند.

پرایمینگ حرارتی با مهار یک جزء ضروری تا زمانی که دستگاه PCR به دمای دناتوراسیون برسد، سنتز DNA را به تاخیر می اندازد.اکثر روش‌های شروع حرارتی دستی، از جمله افزودن تاخیری Taq DNA پلیمراز، به ویژه برای کاربردهای با توان بالا، دشوار هستند.سایر روش‌های پرایمینگ حرارتی از محافظ مومی برای محصور کردن یک جزء ضروری، از جمله یون‌های منیزیم یا آنزیم‌ها، یا جداسازی فیزیکی اجزای واکنش‌دهنده، مانند قالب‌ها و بافرها استفاده می‌کنند.در طول چرخه حرارتی، اجزای مختلف آزاد شده و با ذوب شدن موم با هم مخلوط می شوند.مانند روش شروع گرم دستی، روش محافظ موم دست و پا گیر و مستعد آلودگی است و برای کاربردهای با توان بالا مناسب نیست.

پلاتین DNA پلیمراز برای PCR شروع گرم خودکار مناسب و کارآمد است.پلاتین Taq DNA پلیمراز از Taq DNA پلیمراز نوترکیب ترکیب شده با آنتی بادی مونوکلونال علیه Taq DNA پلیمراز تشکیل شده است.آنتی بادی ها توسط PCR برای مهار فعالیت آنزیم در طول نگهداری طولانی مدت دما فرموله می شوند.Taq DNA پلیمراز در طول عایق 94 درجه سانتیگراد مرحله دناتوراسیون در واکنش آزاد شد و فعالیت کامل پلیمراز را بازیابی کرد.آنزیم پلاتین برخلاف DNA پلیمراز اصلاح شده شیمیایی برای شروع حرارتی، نیازی به عایق طولانی مدت در دمای 94 درجه سانتیگراد (10 تا 15 دقیقه) برای فعال کردن پلیمراز ندارد.با PlatinumTaq DNA پلیمراز، 90 درصد از فعالیت Taq DNA پلیمراز پس از 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد بازیابی شد.

Foreasy HS Taq DNA Polymerase

11. Nest-PCR

دورهای متوالی تقویت با استفاده از پرایمرهای تو در تو می تواند ویژگی و حساسیت را بهبود بخشد.دور اول یک تقویت استاندارد 15 تا 20 سیکل است.بخش کوچکی از محصول تقویت اولیه 100 تا 1000 بار رقیق شد و به دور دوم تقویت برای 15 تا 20 سیکل اضافه شد.روش دیگر، محصول تقویت شده اولیه را می توان با خالص سازی ژل اندازه گیری کرد.یک پرایمر تو در تو در دور دوم تقویت استفاده می شود که می تواند به دنباله هدف داخل پرایمر اول متصل شود.استفاده از PCR تو در تو، امکان تقویت مکان های هدف متعدد را کاهش می دهد زیرا توالی های هدف کمی مکمل هر دو مجموعه پرایمر هستند.تعداد کل سیکل های یکسان (30 تا 40) با پرایمرهای یکسان، مکان های غیر اختصاصی را تقویت کرد.Nested PCR حساسیت توالی های هدف محدود (مثلاً mrnas نادر) را افزایش می دهد و ویژگی PCRS دشوار را بهبود می بخشد (مثلاً 5' RACE).

12. PCR نزولی

PCR نزولی با استفاده از شرایط بازپخت سخت برای چند سیکل اول PCR ویژگی را بهبود می بخشد.چرخه با دمای بازپخت تقریباً 5 درجه بالاتر از Tm تخمین زده شده شروع می شود، سپس هر چرخه 1 درجه تا 2 درجه سانتیگراد کاهش می یابد تا دمای آنیل به زیر 5 درجه سانتیگراد Tm برسد.فقط الگوی مقصد با بالاترین همسانی تقویت خواهد شد.این محصولات در چرخه های بعدی به گسترش خود ادامه می دهند و محصولات غیر اختصاصی تقویت شده را از بین می برند.PCR نزولی برای روش هایی مفید است که درجه همولوژی بین پرایمر و الگوی هدف مشخص نیست، مانند انگشت نگاری DNA AFLP.

کیت های PCR مرتبط

 PCR Easyᵀᴹ (با رنگ)

قهرمان 2× PCR^TMسیستم Mix نسبت به سیستم PCR Mix معمولی تحمل بیشتری نسبت به مهارکننده های PCR دارد و به راحتی می تواند با تقویت PCR قالب های پیچیده مختلف مقابله کند.سیستم واکنش منحصر به فرد و Taq Hero با راندمان بالا باعث می شود که واکنش PCR دارای راندمان تقویت، ویژگی و حساسیت بالاتری باشد.

 PCR Heroᴹ (با رنگ)

راندمان تقویت بالاتر

دارای فعالیت DNA پلیمراز 5'→3' و فعالیت اگزونوکلئاز 5'→3'، بدون فعالیت اگزونوکلئاز 3'→5' است.

کیت Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I

بافر اختصاصی بهینه و آنزیم Taq شروع داغ می تواند از تقویت غیر اختصاصی و تشکیل دایمر پرایمر جلوگیری کند.

حساسیت بالا - می تواند کپی های کم الگو را تشخیص دهد

RT-PCR Easyᵀᴹ I (One Step)

این کیت از یک معرف منحصر به فرد رونویسی معکوس Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase همراه با یک سیستم واکنش منحصر به فرد برای بهبود موثر بازده تقویت و ویژگی واکنش استفاده می کند.