فلورسانس کمی PCR (همچنین به عنوان TaqMan PCR، از این پس به عنوان FQ-PCR نامیده می شود) یک فن آوری کمی اسید نوکلئیک جدید است که توسط PE (Perkin Elmer) در ایالات متحده در سال 1995 توسعه یافته است. این فناوری بر اساس PCR معمولی با افزودن پروب های دارای برچسب فلورسنت است.در مقایسه با PCR انعطاف پذیر، FQ-PCR مزایای زیادی برای تحقق عملکرد کمی آن دارد.این مقاله قصد دارد به طور خلاصه ویژگی ها، اصول، روش ها و کاربردهای فناوری را شرح دهد.

1 ویژگی ها

FQ-PCR نه تنها حساسیت بالایی نسبت به PCR معمولی دارد، بلکه به دلیل استفاده از پروب های فلورسنت، می تواند مستقیماً تغییر سیگنال فلورسنت را در حین تقویت PCR از طریق سیستم هدایت فوتوالکتریک تشخیص دهد تا نتایج کمی را به دست آورد، که بر بسیاری از کاستی های PCR معمولی غلبه می کند، بنابراین دارای ویژگی بالای فناوری و دقت بالای DNA hycurrosco است.

به عنوان مثال، محصولات PCR عمومی باید با الکتروفورز ژل آگارز و رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید با نور ماوراء بنفش یا با الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و رنگ‌آمیزی نقره مشاهده شوند.این نه تنها به ابزارهای متعدد نیاز دارد، بلکه زمان و تلاش نیز می طلبد.لکه های استفاده شده از اتیدیوم بروماید برای بدن انسان مضر است و این روش های آزمایشی پیچیده فرصت هایی را برای آلودگی و مثبت کاذب فراهم می کند.با این حال، FQ-PCR تنها نیاز به باز کردن درب یک بار در طول بارگذاری نمونه دارد، و فرآیند بعدی کاملاً لوله بسته است، که نیازی به PCR پس از پردازش ندارد و از بسیاری از اشکالات در عملیات PCR معمولی جلوگیری می کند.این آزمایش به طور کلی از چرخه حرارتی ABI7100 PCR که توسط شرکت PE ساخته شده است استفاده می کند.

این ابزار دارای ویژگی های زیر است: ① کاربرد گسترده: می توان از آن برای تعیین کمیت محصول PCR DNA و RNA، تحقیقات بیان ژن، تشخیص پاتوژن و بهینه سازی شرایط PCR استفاده کرد.② اصل کمی منحصر به فرد: با استفاده از پروب های دارای برچسب فلورسنت، مقدار فلورسانس با چرخه PCR پس از تحریک لیزر جمع می شود تا به هدف کمی سازی برسد.③ راندمان کاری بالا: سیکلر حرارتی 9600 PCR داخلی، 1 تا 2 ساعت با کامپیوتر کنترل می شود تا تقویت و تعیین کمیت 96 نمونه به طور خودکار و همزمان انجام شود.④ بدون نیاز به الکتروفورز ژل: بدون نیاز به رقیق کردن و الکتروفورز نمونه، فقط از یک پروب مخصوص برای تشخیص مستقیم در لوله واکنش استفاده کنید.⑤ بدون آلودگی در خط لوله: لوله واکنش کاملاً محصور منحصر به فرد و سیستم هدایت فوتوالکتریک اتخاذ شده است، بنابراین نیازی به نگرانی در مورد آلودگی نیست.⑥ نتایج قابل تکرار هستند: محدوده دینامیکی کمی تا پنج مرتبه بزرگی است.بنابراین، از زمانی که این فناوری با موفقیت توسعه یافت، مورد توجه بسیاری از محققان علمی قرار گرفت و در بسیاری از زمینه ها مورد استفاده قرار گرفت.

2 اصول و روشها

اصل کار FQ-PCR استفاده از فعالیت اگزونوکلئاز 5'→3' آنزیم Taq برای افزودن یک پروب نشاندار شده با فلورسنت به سیستم واکنش PCR است.پروب می تواند به طور خاص با الگوی DNA موجود در توالی پرایمر هیبرید شود.انتهای 5 پروب با ژن نشر فلورسانس FAM (6-کربوکسی فلورسین، پیک انتشار فلورسانس در 518 نانومتر)، و انتهای 3 با گروه خاموش کننده فلورسانس TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, 6-carboxytramethylrhodamine, 6-carboxytramethylrhodamgins, 518nm) برچسب گذاری شده است. پروب فسفریله می شود تا از گسترش پروب در طی تقویت PCR جلوگیری شود.هنگامی که کاوشگر دست نخورده باقی می ماند، گروه خاموش کننده انتشار فلورسانس گروه ساطع کننده را سرکوب می کند.هنگامی که گروه ساطع کننده از گروه کوئنچ جدا می شود، مهار برداشته می شود، و چگالی نوری در 518 نانومتر افزایش می یابد و توسط سیستم تشخیص فلورسانس شناسایی می شود. در مرحله تغییر طبیعت، پروب با DNA الگو هیبرید می شود و آنزیم Taq در فاز پرایمر DNA همراه با گسترش الگویی حرکت می کند.هنگامی که پروب قطع می شود، اثر خاموشی آزاد می شود و سیگنال فلورسنت آزاد می شود.هر بار که الگو کپی می شود، یک کاوشگر قطع می شود که همراه با انتشار یک سیگنال فلورسنت است.از آنجایی که یک رابطه یک به یک بین تعداد فلوروفورهای آزاد شده و تعداد محصولات PCR وجود دارد، می توان از این تکنیک برای تعیین کمیت الگو استفاده کرد.ابزار آزمایشی به طور کلی از چرخه حرارتی ABI7100 PCR که توسط شرکت PE ساخته شده است استفاده می کند و می توان از سایر سیکلرهای حرارتی نیز استفاده کرد.اگر از سیستم واکنش نوع واکنش ABI7700 برای آزمایش استفاده شود، پس از تکمیل واکنش، می توان نتایج کمی را مستقیماً از طریق تجزیه و تحلیل کامپیوتری ارائه کرد.اگر از سایر سیکلرهای حرارتی استفاده می کنید، باید از یک آشکارساز فلورسانس برای اندازه گیری سیگنال فلورسانس در لوله واکنش همزمان برای محاسبه RQ+, RQ-, △RQ استفاده کنید.RQ+ نشان دهنده نسبت شدت درخشندگی گروه انتشار فلورسنت لوله نمونه به شدت لومینسانس گروه خاموش کننده است، RQ- نشان دهنده نسبت این دو در لوله خالی است، می توان به دست آورد.با توجه به معرفی پروب های فلورسنت، ویژگی آزمایش به طور قابل توجهی بهبود یافته است.طراحی پروب به طور کلی باید شرایط زیر را داشته باشد: ①طول پروب باید حدود 20-40 پایه باشد تا از ویژگی اتصال اطمینان حاصل شود.②محتوای بازهای GC بین 40 تا 60 درصد است تا از تکرار توالی های تک نوکلئوتیدی جلوگیری شود.③ از هیبریداسیون یا همپوشانی با پرایمرها خودداری کنید.④ پایداری اتصال بین پروب و قالب بیشتر از پایداری اتصال بین پرایمر و قالب است، بنابراین مقدار Tm پروب باید حداقل 5 درجه سانتیگراد بالاتر از مقدار Tm پرایمر باشد.علاوه بر این، غلظت پروب، همسانی بین پروب و دنباله الگو، و فاصله بین پروب و پرایمر همگی بر نتایج تجربی تأثیر دارند.

محصولات مرتبط:

چین Lnc-RT Heroᵀᴹ I(With gDNase) (Super Premix for first-strand cDNA synthesis from lncRNA) سازنده و تامین کننده |Foregene (foreivd.com)

چین Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman سازنده و تامین کننده |Foregene (foreivd.com)