آزمایش RT-qPCR شامل استخراج RNA و ارزیابی کیفیت، رونویسی معکوس و qPCR سه مرحله است، هر مرحله اقدامات احتیاطی زیادی دارد که در زیر به طور مفصل معرفی خواهیم کرد.

Ⅰ.ارزیابی کیفیت RNA

در آزمایش RT-qPCR، پس از اتمام استخراج RNA، کیفیت RNA نیاز به ارزیابی دارد و آزمایش بعدی تنها پس از واجد شرایط بودن می‌تواند انجام شود.روش‌های ارزیابی شامل اسپکتروفتومتر، الکتروفورز ژل Agilent، آنالیز Agilent 2100 می‌باشد که در میان آنها پرکاربردترین اسپکتروفتومتر و تشخیص روش الکتروفورز ژل آگارز است.لازم به ذکر است که این دو روش برای تکمیل تشخیص و تجزیه و تحلیل غلظت، خلوص و یکپارچگی RNA باید با هم استفاده شوند تا از کیفیت RNA اطمینان حاصل شود.

کیت جداسازی RNA مرتبط: 

کیت جداسازی RNA توتال سلولی

RNA کل بسیار خالص و با کیفیت بالا را می توان از سلول های کشت شده مختلف در 11 دقیقه به دست آورد.

کیت جداسازی RNA توتال حیوانات

استخراج سریع و کارآمد RNA کل با خلوص بالا و با کیفیت بالا از بافت های مختلف حیوانات.

اسپکتروفتومتر:

اسپکتروفتومتر عمدتاً برای تعیین غلظت و خلوص RNA استفاده می شود، اما نمی تواند یکپارچگی RNA و باقیمانده ژنومی را تشخیص دهد.در میان آنها، A260/280 و A260/230 پارامترهای مهم برای تشخیص خلوص RNA هستند و خلوص RNA را می توان با توجه به نوسان مقادیر آنها تشخیص داد:

1. 1.92.1، نشان دهنده تخریب جزئی احتمالی RNA است که می تواند با الکتروفورز ژل آگارز بیشتر تایید شود.

2. 2.0

الکتروفورز ژل آگارز:

روش الکتروفورز ژل آگارز می‌تواند یکپارچگی RNA، ژنوم و باقیمانده‌های پروتئین را تجزیه و تحلیل کند، اما نمی‌تواند غلظت RNA را به دقت تعیین کند یا بقایای معرف‌های آلی را تشخیص دهد.برای مثال الگوهای RNA یوکاریوتی را در نظر بگیرید:

1. RNA تحت الکتروفورز ژل آگارز قرار گرفت.اگر روی نقشه ژل تنها سه باند منفرد از 28sRNA، 18sRNA و 5.8sRNA وجود داشته باشد، نشان می دهد که RNA استخراج شده دست نخورده است.اگر پدیده درگ وجود داشته باشد، نشان دهنده تخریب جزئی RNA است.

2. اگر یک نوار روشن بین سوراخ چسب و نوار 28sRNA وجود داشته باشد، ممکن است باقیمانده DNA ژنومی وجود داشته باشد.

3. اگر نوارهایی در سوراخ چسب ظاهر شود، نشان می دهد که ممکن است باقیمانده های پروتئین و سایر مواد درشت مولکولی وجود داشته باشد.

Ⅱ. رونویسی معکوس

پس از اتمام استخراج RNA، برای آزمایش های بعدی باید به cDNA برگردانده شود، بنابراین مرحله معکوس ضروری است.رونویسی معکوس از انتخاب رونوشت معکوس و آغازگر معرفی خواهد شد:

انتخاب رونوشت معکوس:

رونوشت‌های معکوس معمولی شامل AMV RTase و MMLV RTase هستند.RNase H AMV RTase دارای فعالیت قوی، طول سنتز کوتاه، مقدار سنتز کم و پایداری حرارتی خوب (42 ~ 55 ℃) است.فعالیت RNase H MMLV RTase ضعیف است، طول سنتز طولانی است، مقدار سنتز بالا است، و پایداری حرارتی ضعیف است (37 ~ 42 ℃).

از آنجا که آنزیم RNase H عملکرد الگوی RNA را تجزیه می کند، MMLV با فعالیت ضعیف RNase H باید ترجیحاً در طول رونویسی معکوس انتخاب شود و پس از مهندسی ژنتیک بعدی، پایداری حرارتی MMLV به یک جهش کیفی رسیده است.مصرف فورجینForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV برای رونویسی معکوس) به عنوان مثال، این یک رونوشت معکوس جدید است که در باکتری های E. coli مهندسی شده با استفاده از فناوری نوترکیبی ژنتیکی بیان شده است.این یک DNA پلیمراز نوترکیب است که یک رشته DNA مکمل را از RNA تک رشته ای، DNA یا یک هیبرید RNA:DNA سنتز می کند.هیچ فعالیت RNase H، پایداری قوی، میل ترکیبی قوی RNA و حساسیت تشخیص بالا ندارد.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV برای رونویسی معکوس)

انتخاب پرایمر:

به طور کلی پرایمرهای RT به سه دسته تقسیم می شوند: اولیگو dT، پرایمرهای تصادفی و پرایمرهای اختصاصی ژن.پرایمرهای مناسب را برای استفاده با توجه به نیازهای آزمایشی مختلف انتخاب کنید.

1. اگر الگو منشا یوکاریوتی داشته باشد و از cDNA متأخر برای تقویت معمول PCR استفاده شود، Oligo (dT) توصیه می شود.اگر آزمایش بعدی فقط برای qPCR استفاده شود، Oligo (dT) برای بهبود کارایی رونویسی معکوس توصیه می شود با پرایمرهای تصادفی مخلوط شود.

2. اگر الگو از پروکاریوت ها باشد، پرایمرهای تصادفی یا پرایمرهای اختصاصی ژن باید برای رونویسی معکوس انتخاب شوند.

Ⅲ.qPCR

کمی سازی فلورسانس عمدتاً از انتخاب روش های کمی، اصول طراحی پرایمر، انتخاب ROX، پیکربندی سیستم واکنش و تنظیم شرایط واکنش و غیره تشریح شده است.

انتخاب روش های کمی:

روش های کمی به روش های کمی نسبی و روش های کمی مطلق تقسیم می شوند.کمیت نسبی را می توان برای تشخیص تأثیر روش های درمانی خاص بر بیان ژن، تشخیص تفاوت بیان ژن در زمان های مختلف و مقایسه تفاوت بیان ژن در بافت های مختلف استفاده کرد.کمیت مطلق می تواند مقدار اسید نوکلئیک در ویروس و غیره را تشخیص دهد.هنگام انجام آزمایش ها باید روش های کمی مناسب را با توجه به آزمایش های خود انتخاب کنیم.

اصول طراحی پرایمر:

طراحی پرایمر برای qPCR به طور مستقیم با راندمان تقویت و ویژگی محصول مرتبط است.بنابراین، طراحی صحیح پرایمرهای خوب اولین گام موفقیت آمیز qPCR است.در طراحی پرایمر هنگام رعایت اصل طراحی پرایمر معمولی باید به اصول زیر توجه کرد:

1. طول قطعه هدف بین 100 تا 300 جفت باز کنترل می شود.

2. طراحی متقاطع اگزون برای جلوگیری از تأثیر DNA ژنومی.

3. آغازگرهای طراحی شده نیاز به آزمایش بازده تقویت دارند و تنها زمانی که راندمان تقویت به استاندارد (90-110٪) برسد، می توان از آنها برای آزمایش های کمی استفاده کرد.

4. غلظت پرایمر معمولا بین 0.1uM و 1.0uM بهینه می شود.

انتخاب ازROX:

در فرآیند واکنش کمی، ROX می تواند تفاوت مسیر نوری، خطای پیپت یا اختلاف حجم ناشی از تبخیر و تراکم را به طور یکنواخت تنظیم کند و تکرارپذیری نتایج را بهبود بخشد.البته لازم به ذکر است که انتخاب ROX مربوط به ساز می باشد.اگر دستگاه qPCR عملکرد تصحیح خودکار تفاوت بین سوراخ ها را داشته باشد، نیازی به افزودن ROX نیست.در غیر این صورت، باید اصلاح ROX را اضافه کند.شرکای کوچک در خرید معرف ها باید مطابق با ابزار مورد استفاده برای انتخاب ROX صحیح باشند، از اشتباهات بعدی اجتناب کنید.

آماده سازی سیستم واکنش:

حجم واکنش 20 و 50 ul ترجیح داده می شود.هنگام تدوین سیستم باید به موارد زیر توجه کرد:

1. سیستم واکنش باید با تهویه در میز کار فوق تمیز، ddH جدید آماده شود.₂O برای هر آزمایش استفاده می شود.

2. هر آزمایش باید NTC را آماده کند تا بررسی شود که آیا آلودگی در سیستم وجود دارد یا خیر، و هر جفت آغازگر باید NTC را هنگام تهیه سیستم انجام دهد.

3. برای تشخیص وجود باقیمانده gDNA در الگوی RNA، NRT را می توان برای هر نمونه برای تشخیص آماده کرد.

4. هنگام آماده سازی سیستم، توصیه می شود حداقل 3 تکرار فنی برای یک نمونه انجام شود.

5. هنگامی که الگو cDNA است، توصیه می شود 5-10 بار رقیق شود تا اثر بازداری سیستم رونویسی معکوس در آزمایش qPCR کاهش یابد.بهتر است کمیت الگو را با گرادیان بررسی کنید، به طوری که مقدار CT بین 20-30 قرار گیرد.

6. تعداد واکنش های مورد نیاز را تعیین کنید، 5-10٪ بر اساس تعداد واکنش ها افزایش دهید، و عدد پیکربندی حجم را محاسبه کنید.

7، سیستم با استفاده از اصل پیش مخلوط آماده می شود، پس از سانتریفیوژ مخلوط می شود و از عدم وجود حباب اطمینان می یابد.

8، تا آنجا که ممکن است برای انتخاب مواد مصرفی پشتیبانی.

کیت RT-qPCR مرتبط