RNA استخراج نمی شود یا بازده RNA کم است

اغلب عوامل مختلفی وجود دارد که بر کارایی بازیابی تأثیر می گذارد، مانند: محتوای RNA نمونه بافت، روش کار، حجم شستشو و غیره.

1. حمام یخ یا سانتریفیوژ برودتی (4 درجه سانتیگراد) در طول عملیات انجام شد.

توصیه: در تمام مراحل در دمای اتاق (15-25 درجه سانتیگراد) کار کنید، از حمام یخ خودداری کنید و در دمای پایین سانتریفیوژ کنید.

2. نگهداری نامناسب نمونه یا زمان نگهداری بیش از حد نمونه.

توصیه: نمونه ها را در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری کنید یا در نیتروژن مایع منجمد کنید و از استفاده مکرر انجماد و ذوب خودداری کنید.سعی کنید از بافت تازه یا سلول های کشت داده شده برای استخراج RNA استفاده کنید.

3. لیز نمونه ناکافی.

توصیه: هنگام همگن سازی بافت، اطمینان حاصل کنید که بافت به اندازه کافی همگن شده است و سلول های بافت به اندازه کافی شکافته شده اند تا آزاد شدن RNA را توضیح دهند.

4. شوینده به درستی اضافه نشده است.

توصیه: تأیید کنید که RNase-Free ddH₂O به صورت قطره ای به وسط غشای ستون تصفیه اضافه می شود.

5. حجم صحیح اتانول مطلق به بافر RL2 یا بافر RW2 اضافه نشده است.

توصیه: دستورالعمل ها را دنبال کنید، حجم صحیح اتانول مطلق را به بافر RL2 و بافر RW2 اضافه کنید و قبل از استفاده از کیت خوب مخلوط کنید.

6. دوز نمونه بافت مناسب نیست.

توصیه: از 10-20 میلی گرم بافت یا (1-5) × 10 استفاده کنید⁶سلول ها در هر 500 میکرولیتر بافر RL1، زیرا استفاده بیش از حد از بافت می تواند منجر به کاهش استخراج RNA شود.

7. حجم شستشو نامناسب یا شستشوی ناقص.

توصیه: حجم شستشوی ستون تصفیه 50-200 میکرولیتر است.اگر اثر شستشو رضایت بخش نباشد، توصیه می شود پس از افزودن ddH بدون RNase از قبل گرم شده، زمان قرارگیری در دمای اتاق را افزایش دهید.₂O، به عنوان مثال برای 5-10 دقیقه.

8. ستون تصفیه دارای باقیمانده اتانول پس از شستشو بافر RW2 است.

توصیه: اگر پس از شستشوی بافر RW2 باقیمانده اتانول وجود داشت، سانتریفیوژ لوله خالی را به مدت 1 دقیقه، زمان عملیات سانتریفیوژ لوله خالی را می توان به 2 دقیقه افزایش داد، یا ستون تصفیه را می توان به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار داد تا اتانول باقیمانده به اندازه کافی حذف شود.

RNA خالص تجزیه می شود

کیفیت RNA خالص به عواملی مانند حفظ نمونه، آلودگی RNase و دستکاری و غیره مرتبط است.

1. نمونه های بافت به موقع نگهداری نمی شوند.

توصیه: اگر نمونه های بافتی یا سلول ها پس از جمع آوری به موقع استفاده نشد، بلافاصله در دمای 80- درجه سانتی گراد یا نیتروژن مایع نگهداری شود.برای استخراج RNA، در صورت امکان از بافت یا نمونه سلولی تازه گرفته شده استفاده کنید.

2. انجماد-ذوب مکرر نمونه های بافت.

توصیه: هنگام نگهداری نمونه‌های بافت، بهتر است برای نگهداری آن‌ها را به قطعات کوچک برش دهید و هنگام استفاده از آن‌ها یکی از قطعات را جدا کنید تا از انجماد و ذوب مکرر نمونه و تخریب RNA جلوگیری شود.

3. RNase معرفی شده یا عدم استفاده از دستکش، ماسک و ... در حین عمل.

توصیه: آزمایش‌های استخراج RNA بهتر است در اتاق‌های دستکاری RNA جداگانه انجام شود و جدول قبل از آزمایش پاک شود.

در طول آزمایش از دستکش و ماسک یکبار مصرف استفاده کنید تا تخریب RNA ناشی از معرفی RNase را به حداقل برسانید.

4. معرف ها در حین استفاده به RNase آلوده می شوند.

توصیه: برای آزمایش های مرتبط با کیت جداسازی RNA توتال جانوری جدید جایگزین کنید.

5. لوله های سانتریفیوژ، نوک ها و غیره مورد استفاده در دستکاری RNA به RNase آلوده هستند.

توصیه: مطمئن شوید که لوله‌های سانتریفیوژ، نوک‌ها، پیپت‌ها و غیره مورد استفاده در استخراج RNA همگی فاقد RNase هستند.

RNA به‌دست‌آمده خالص‌شده بر آزمایش‌های پایین دست تأثیر می‌گذارد

RNA خالص شده توسط ستون تصفیه، اگر یون های نمک، محتوای پروتئین بیش از حد بزرگ باشد، آزمایش پایین دست را تحت تاثیر قرار می دهد، مانند: رونویسی معکوس، نورترن بلات و همکاران.

1. RNA شسته شده دارای بقایای یون نمک است.

توصیه: تأیید کنید که حجم صحیح اتانول به بافر RW2 اضافه شده است و 2 شستشوی ستون تصفیه را با سرعت گریز از مرکز نشان داده شده برای عملیات انجام دهید.در صورت وجود باقیمانده یون نمک، ستون تصفیه را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در بافر RW2 بگذارید و سانتریفیوژ را انجام دهید تا آلودگی نمک را به حداکثر برسانید.

2. باقی مانده اتانول در RNA شسته شده.

توصیه: اطمینان حاصل کنید که پس از شستشوی بافر RW2، عملیات سانتریفیوژ لوله خالی را با سرعت سانتریفیوژ نشان داده شده برای کار انجام دهید، در صورت وجود باقیمانده اتانول، زمان عملیات سانتریفیوژ لوله خالی را به 2 دقیقه افزایش دهید یا آن را به مدت 5 متر در دمای اتاق بگذارید.