کیت سلولی مستقیم RT qPCR—SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell Ready یک مرحله ای qRT-PCR کیت
توضیحات
این کیت از یک سیستم بافر لیز منحصربه‌فرد استفاده می‌کند که می‌تواند به سرعت RNA را از نمونه‌های سلولی کشت‌شده برای واکنش‌های RT-qPCR آزاد کند و در نتیجه فرآیند خالص‌سازی RNA زمان‌بر و پر زحمت را حذف کند.الگوی RNA را می توان تنها در 7 دقیقه به دست آورد.5×مستقیم RT Mix و 2×معرف های مستقیم qPCR Mix-SYBR ارائه شده توسط کیت می توانند به سرعت و به طور موثر نتایج کمی PCR را در زمان واقعی بدست آورند.
5×مستقیم RT Mix و 2×مستقیم qPCR Mix-SYBR دارای تحمل بازدارنده قوی است و لیز نمونه ها را می توان به عنوان الگوی مستقیم برای RT-qPCR استفاده کرد.این کیت حاوی RNA منحصر به فرد با میل ترکیبی بالا Foregene رونوشت معکوس، و Hot D-Taq DNA پلیمراز، dNTPs، MgCl است.2بافر واکنش، بهینه ساز و تثبیت کننده PCR.
مشخصات فنی
200×20μl Rxns، 1000×20μl Rxns
اجزای کیت
| قسمت اول | بافر CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| بافر ST | |
| قسمت دوم | پاک کن DNA |
| 5× میکس مستقیم RT | |
| 2× مستقیم qPCR Mix-SYBR | |
| رنگ مرجع 50× ROX | |
| ddH2O بدون RNase | |
| دستورالعمل ها | |
ویژگی ها و مزایا
■ساده و موثر: با فناوری Cell Direct RT، نمونه های RNA را می توان تنها در 7 دقیقه به دست آورد.
■ تقاضای نمونه کم است، تا 10 سلول را می توان آزمایش کرد.
■ توان عملیاتی بالا: می تواند به سرعت RNA را در سلول های کشت شده در صفحات 384، 96، 24، 12، 6 چاهی تشخیص دهد.
■ پاک‌کن DNA می‌تواند ژنوم‌های آزاد شده را به سرعت حذف کند و تأثیر آن بر نتایج آزمایشی بعدی را تا حد زیادی کاهش دهد.
■ سیستم RT و qPCR بهینه شده، رونویسی معکوس دو مرحله ای RT-PCR را کارآمدتر و PCR را خاص تر و در برابر مهارکننده های واکنش RT-qPCR مقاوم تر می کند.
اپلیکیشن کیت
دامنه کاربرد: سلول های کشت شده.
- RNA منتشر شده توسط لیز نمونه: فقط برای الگوی RT-qPCR این کیت قابل استفاده است.
- کیت را می توان برای اهداف زیر استفاده کرد: تجزیه و تحلیل بیان ژن، تأیید اثر خاموشی ژن با واسطه siRNA، غربالگری دارو و غیره.
نمودار
ذخیره سازی و ماندگاری
قسمت اول این کیت باید در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود.قسمت دوم باید در دمای -20 درجه سانتیگراد ذخیره شود.
Foregene Protease Plus II باید در 4 ذخیره شود℃، در -20 درجه یخ نزنید.
معرف 2×مستقیم qPCR Mix-SYBR باید در -20 ذخیره شود℃در تاریکی؛در صورت استفاده مکرر، می توان آن را در 4 نیز ذخیره کرد℃ برای ذخیره سازی کوتاه مدت (در مدت 10 روز استفاده کنید).
اصول طراحی پرایمر Real Time PCR
پرایمر جلو و پرایمر معکوس
برای Real Time PCR، طراحی پرایمر بسیار مهم است.پرایمرها به ویژگی و کارایی تقویت PCR مربوط می شوند و می توانند با توجه به اصول زیر طراحی شوند:
طول پرایمر: 18-30 جفت باز.
محتوای GC: 40-60٪.
مقدار Tm: نرم افزار طراحی پرایمر مانند Primer 5 می تواند مقدار Tm پرایمر را بدهد.مقادیر Tm پرایمرهای بالادست و پایین دست باید تا حد امکان نزدیک باشد.از فرمول محاسبه Tm نیز می توان استفاده کرد: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).هنگام انجام PCR، دمای کمتر از مقدار Tm پرایمر 5 درجه سانتیگراد به طور کلی به عنوان دمای بازپخت انتخاب می شود (افزایش متناظر در دمای آنیل می تواند ویژگی واکنش PCR را افزایش دهد).
پرایمرها و محصولات PCR:
طول محصول تقویت PCR پرایمر طراحی ترجیحاً 100-150 جفت باز است.
تا حد امکان از پرایمرهای طراحی در ناحیه ساختاری ثانویه قالب اجتناب شود.
از تشکیل 2 یا بیشتر پایه مکمل بین انتهای 3 پرایمرهای بالادست و پایین دست خودداری کنید.
پایه پایانه پرایمر 3 نمی تواند با 3 G یا C متوالی اضافی وجود داشته باشد.
خود پرایمرها نمی توانند ساختارهای مکمل داشته باشند، در غیر این صورت یک ساختار سنجاق سر تشکیل می شود که بر تقویت PCR تأثیر می گذارد.
ATCG باید تا حد امکان به طور یکنواخت در توالی پرایمر توزیع شود و از پایه ترمینال 3 به عنوان T اجتناب شود.
ضمیمه 1: بسته مکمل کیت RT-qPCR Cell Direct
1.محلول لیز سلولی
|
| |||
| اجزای کیت (سیستم لیز 24 چاهی / چاه) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 ت | 500 ت | ||
| قسمتمن | بافر CL | 20 میلی لیتر | 100 میلی لیتر |
| Foregene Protease Plus II | 400 میکرولیتر | 1 میلی لیتر × 2 | |
| بافر ST | 1 میلی لیتر × 2 | 10 میلی لیتر | |
| قسمتII | پاک کن DNA | 400 میکرولیتر | 1 میلی لیتر × 2 |
2.RT میکس
|
| |
| اجزای کیت (سیستم واکنش ۲۰ میکرولیتری) | DRT-01011-B1 |
| 200 ت | |
| 5× میکس مستقیم RT | 800 میکرولیتر |
| ddH بدون RNase2O | 1.7 میلی لیتر × 2 |
|
| ||
| اجزای کیت (سیستم واکنش ۲۰ میکرولیتری) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 ت | 1000 ت | |
| 2× مستقیم qPCR Mix-SYBR | 1 میلی لیتر × 2 | 1.7 میلی لیتر × 6 |
| رنگ مرجع 50× ROX | 40 میکرولیتر | 200 میکرولیتر |
| ddH بدون RNase2O | 1.7 میلی لیتر | 10 میلی لیتر |
دفترچه راهنما:
