استریل کردن نوک پیپت و لوله های EP و غیره

1. 0.1% (یک هزارم) DEPC (ماده بسیار سمی) را با آب دیونیزه تهیه کنید، آن را با دقت در هود بخور استفاده کنید و آن را در دمای 4 درجه سانتیگراد دور از نور نگهداری کنید.

آب DEPC آب خالصی است که با DEPC تصفیه شده و با دمای بالا و فشار بالا استریل می شود.بدون RNase، DNase و پروتئیناز آزمایش شده است.

2. نوک پیپت و لوله EP را در 0.1% DEPC قرار دهید و اطمینان حاصل کنید که نوک پیپت و لوله EP با 0.1% DEP پر شده است.

3. از نور محافظت کنید، بگذارید بماند، یک شب (12-24 ساعت)

4. جعبه حاوی نوک و لوله EP نیازی به خیساندن در DEPC ندارد.پس از برداشتن تقریباً آب DEPC در نوک یا لوله EP، آن را بسته بندی کرده و بپیچید.

5. 121 درجه سانتیگراد، 30 دقیقه

6. 180 درجه سانتیگراد، چند ساعت خشک کنید (حداقل 3 ساعت)

توجه: الفهنگام کار با DEPC از دستکش و ماسک لاتکس استفاده کنید!ب، یا بدون استریلیزاسیون DEPC، 130 ℃، اتوکلاو 90 دقیقه (بسیاری از آزمایشگاه ها دو بار استریل در دمای بالا)

ملاحظات استخراج RNA

دو پدیده اصلی شکست جداسازی RNA بافت

تجزیه RNA و باقی مانده ناخالصی ها در بافت ها،در مورد تجزیه، اجازه دهید ابتدا بررسی کنیم که چرا RNA استخراج شده از سلول های کشت شده به راحتی تجزیه نمی شود.معرف های استخراج RNA موجود همگی حاوی اجزایی هستند که به سرعت RNase را مهار می کنند.لیزات را به سلول های کشت شده اضافه کنید و به سادگی آن را مخلوط کنید، تمام سلول ها را می توان به طور کامل با لیز مخلوط کرد و سلول ها کاملاً لیز می شوند.پس از لیز شدن سلول ها، مواد فعال موجود در لیز بلافاصله RNase داخل سلولی را مهار می کنند، بنابراین RNA دست نخورده باقی می ماند.به این معنا که از آنجایی که سلول های کشت شده به راحتی و به طور کامل با ماده لیز در تماس هستند، RNA آنها به راحتی تجزیه نمی شود.از سوی دیگر، RNA موجود در بافت به راحتی تجزیه می‌شود، زیرا سلول‌های بافت به راحتی نمی‌توانند به سرعت با ماده لیز تماس بگیرند.به دلیل تماس کافیبنابراین،با فرض اینکه راهی برای تبدیل بافت به یک سلول واحد و در عین حال مهار فعالیت RNA وجود داشته باشد، مشکل تخریب می‌تواند کاملاً حل شود.

آسیاب نیتروژن مایع موثرترین این روش است.با این حال، روش آسیاب نیتروژن مایع بسیار دردسرساز است، به خصوص زمانی که تعداد نمونه ها زیاد باشد.این امر باعث به وجود آمدن بهترین چیز بعدی شد: هموژنایزر.اینهموژنایزرروش این سوال را در نظر نمی‌گیرد که چگونه فعالیت RNase قبل از تماس سلول‌ها با لیزات مهار می‌شود، بلکه دعا می‌کند که سرعت از هم گسیختگی بافت سریع‌تر از سرعتی که RNase داخل سلولی RN را تجزیه می‌کند باشد.

اثر هموژنایزر الکتریکی بهتر است،و اثر هموژنایزر شیشه ضعیف است اما به طور کلی روش هموژنایزر نمی تواند از پدیده تخریب جلوگیری کند.بنابراین، اگر استخراج تخریب شود، هموژنایزر الکتریکی اصلی باید برای آسیاب با نیتروژن مایع استفاده شود.هموژنایزر شیشه ای اصلی باید به هموژنایزر الکتریکی تغییر یابد یا مستقیماً با نیتروژن مایع آسیاب شود.مشکل تقریبا 100% امکان پذیر است.حل شود

مشکل باقیمانده ناخالصی که آزمایش‌های بعدی را تحت تأثیر قرار می‌دهد، دلایل متنوع‌تری نسبت به تخریب دارد، و راه‌حل‌ها نیز به نسبت متفاوت هستند.در نتیجه،اگر تخریب یا ناخالصی های باقیمانده در بافت وجود داشته باشد، روش استخراج / معرف برای ماده آزمایشی خاص باید بهینه شود.شما مجبور نیستید از نمونه‌های با ارزش خود برای بهینه‌سازی استفاده کنید: می‌توانید چند حیوان کوچک مانند ماهی/مرغ را از بازار بخرید، قسمت مربوطه از مواد را برای استخراج RNA بردارید و قسمت دیگر را برای استخراج پروتئین - با دهان، معده و عصاره روده آسیاب کنید.

RNA هدف RNA استخراج شده برای آزمایش های بعدی مختلف استفاده می شود و الزامات کیفی آن متفاوت است

ساخت کتابخانه cDNA نیاز به یکپارچگی RNA بدون باقی مانده از مهارکننده های واکنش آنزیمی دارد.نورترن به یکپارچگی RNA بالاتر و الزامات کمتری برای باقی مانده های مهارکننده های واکنش آنزیمی نیاز دارد.RT-PCR به یکپارچگی RNA خیلی بالا نیاز ندارد،اما واکنش های آنزیمی را مهار می کند.الزامات باقی مانده سختگیرانه است.ورودی خروجی را تعیین می کند.هر بار که هدف به دست آوردن RNA با بالاترین خلوص باشد، هزینه و هزینه برای مردم خواهد داشت.

جمع آوری / ذخیره سازی نمونه ها

عوامل مؤثر بر تخریب پس از خروج نمونه از بدن زنده/یا محیط رشد اولیه، آنزیم های درون زا در نمونه شروع به تجزیه RNA می کنند.و سرعت تخریب مربوط به محتوای آنزیم های درون زا و دما است.به طور سنتی، تنها دو راه برای مهار کامل فعالیت آنزیم درون زا وجود دارد: بلافاصله لیزات را اضافه کنید و به طور کامل و سریع همگن کنید.به قطعات کوچک برش داده و بلافاصله در نیتروژن مایع فریز کنید.هر دو روش نیاز به عملیات سریع دارند.دومی برای همه نمونه‌ها مناسب است، در حالی که اولی فقط برای بافت‌هایی با محتوای کم سلول و آنزیم‌های درون‌زا مناسب است و راحت‌تر همگن می‌شود.به طور خاص، بافت گیاهی، کبد، تیموس، لوزالمعده، طحال، مغز، چربی، بافت عضلانی و غیره بهتر است قبل از اقدام با نیتروژن مایع منجمد شوند.

تکه تکه شدن و همگن سازی نمونه ها

عوامل موثر بر تخریب و بازده تکه تکه شدن نمونه می باشدبرای همگن سازی کاملکه برای آزادسازی کامل و کامل RNA می باشد.سلول ها را می توان مستقیماً بدون شکستن همگن کرد.بافت ها تنها پس از شکسته شدن می توانند همگن شوند.مخمرها و باکتری ها باید با آنزیم های مربوطه شکسته شوند تا بتوانند همگن شوند.بافت‌هایی با محتوای آنزیم درون‌زا کمتر و همگن‌سازی آسان‌تر را می‌توان در یک زمان در لیز توسط یک هموژنایزر خرد و همگن کرد.بافت گیاهی، کبد، تیموس، لوزالمعده، طحال، مغز، چربی، بافت عضلانی و سایر نمونه ها، یا دارای آنزیم های درون زا هستند یا به راحتی همگن نمی شوند.بنابراین از هم گسیختگی و همگن سازی بافت باید جداگانه انجام شود.مطمئن ترین و پربازده ترین روش تکه تکه شدن آسیاب با نیتروژن مایع و مطمئن ترین روش همگن سازی استفاده از هموژنایزر الکتریکی است.نکته ویژه در مورد آسیاب با نیتروژن مایع: نمونه نباید در طول کل فرآیند آسیاب ذوب شود، زیرا آنزیم های درون زا در هنگام انجماد بیشتر عمل می کنند.

انتخاب لیزات

تأثیر بر راحتی کار و عوامل ناخالصی های درون زا باقیمانده محلول های لیز که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند تقریباً می توانند فعالیت RNase را مهار کنند.بنابراین، نکته کلیدی انتخاب محلول لیز، در نظر گرفتن ترکیبی با روش تصفیه است.یک استثنا وجود دارد:نمونه هایی با محتوای آنزیم درون زا بالا توصیه می شود از لیزات حاوی فنل برای افزایش توانایی غیر فعال کردن آنزیم های درون زا استفاده کنند.

انتخاب روش تصفیه

عواملی که بر ناخالصی‌های درون‌زای باقی‌مانده تأثیر می‌گذارند، سرعت استخراج برای نمونه‌های تمیزی مانند سلول‌ها، تقریباً با هر روش خالص‌سازی در دسترس می‌توان نتایج رضایت‌بخشی به دست آورد.اما برای بسیاری از نمونه‌های دیگر، به‌ویژه نمونه‌هایی که ناخالصی‌های بالایی دارند مانند گیاهان، کبد، باکتری‌ها و غیره، انتخاب یک روش تصفیه مناسب بسیار مهم است.روش خالص سازی گریز از مرکز ستونی دارای سرعت استخراج سریع است و می تواند به طور موثر ناخالصی هایی را که بر واکنش آنزیمی بعدی RNA تأثیر می گذارد حذف کند، اما گران است (فورژن می تواند کیت های مقرون به صرفه ارائه دهد، جزئیات بیشتر کلیک کنیداینجا)با استفاده از روش های تصفیه اقتصادی و کلاسیک مانند رسوب LiCl نیز می توان نتایج رضایت بخشی را به دست آورد، اما زمان عملیات طولانی است..

"سه رشته و هشت توجه" برای استخراج RNA

رشته 1:به آلودگی آنزیم های بیرونی پایان دهید.

یادداشت 1:به شدت از ماسک و دستکش استفاده کنید.

تبصره 2:لوله های سانتریفیوژ، سرهای نوک، میله های پیپت، مخازن الکتروفورز و نیمکت های آزمایشی درگیر در آزمایش باید به طور کامل دور ریخته شوند.

نکته 3:معرف ها/محلول های درگیر در آزمایش، به ویژه آب، باید فاقد RNase باشند.

رشته 2:فعالیت آنزیم های درون زا را مسدود کنید

تبصره 4:یک روش همگن سازی مناسب را انتخاب کنید.

تبصره 5:لیزات مناسب را انتخاب کنید.

تبصره 6:مقدار شروع نمونه را کنترل کنید.

رشته 3:هدف استخراج خود را روشن کنید

تبصره 7:با نزدیک شدن هر سیستم لیز به حداکثر مقدار اولیه نمونه، میزان موفقیت استخراج به شدت کاهش می یابد.

تبصره 8:تنها معیار اقتصادی برای استخراج موفق RNA، موفقیت در آزمایش‌های بعدی است، نه بازده.

10 منبع اصلی آلودگی RNase

1. انگشتان اولین منبع آنزیم های اگزوژن هستند، بنابراین دستکش ها باید مرتباً پوشیده و تعویض شوند.علاوه بر این، ماسک نیز باید پوشیده شود، زیرا تنفس نیز منبع مهمی از آنزیم ها است.یکی دیگر از مزایای پوشیدن ماسک دستکش، محافظت از آزمایشگر است.

2. نوک پیپت، لوله سانتریفیوژ، پیپت - RNase را نمی توان تنها با استریل کردن غیرفعال کرد، بنابراین نوک پیپت و لوله های سانتریفیوژ باید با DEPC درمان شوند، حتی اگر به عنوان DEPC نشان داده شده باشند.بهتر است از یک پیپت با کاربرد خاص استفاده کنید، قبل از استفاده، آن را با پنبه 75٪ الکل پاک کنید، به خصوص میله را.علاوه بر این، مطمئن شوید که از حذف کننده سر استفاده نکنید.

3. آب/بافر باید عاری از آلودگی RNase باشد.

4. حداقل میز آزمایش باید با پنبه 75 درصد الکل تمیز شود.

5. RNase درون زا همه بافت ها حاوی آنزیم های درون زا هستند، بنابراین انجماد سریع بافت ها با نیتروژن مایع بهترین راه برای کاهش تخریب است.روش ذخیره سازی/ آسیاب نیتروژن مایع در واقع ناخوشایند است، اما تنها راه برای بافت هایی با سطوح بالای آنزیم های درون زا است.

6. نمونه های RNA محصولات استخراج RNA ممکن است حاوی ردپایی از آلودگی RNase باشند.

7. استخراج پلاسمید در استخراج پلاسمید اغلب از Rnase برای تجزیه RNA استفاده می شود و Rnase باقیمانده باید با پروتئیناز K هضم و توسط PCI استخراج شود.

8. ذخیره سازی RNA حتی اگر در دمای پایین ذخیره شود، مقادیر کمی از RNase باعث تخریب RNA می شود.بهترین راه حل برای حفظ طولانی مدت RNA سوسپانسیون نمک/الکل است، زیرا الکل تمام فعالیت های آنزیمی را در دماهای پایین مهار می کند.

9. هنگامی که کاتیون ها (Ca, Mg) حاوی این یون ها هستند، حرارت دادن در دمای 80 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه باعث جدا شدن RNA می شود، بنابراین اگر RNA نیاز به حرارت داشته باشد، محلول نگهدارنده باید حاوی یک عامل کیلیت (1 میلی مولار سدیم سیترات، pH 6.4) باشد.

10. آنزیم های مورد استفاده در آزمایش های بعدی ممکن است توسط RNase آلوده شوند.

10 نکته برای استخراج RNA

1: به سرعت از فعالیت RNase جلوگیری کنید.نمونه ها پس از جمع آوری به سرعت منجمد می شوند و RNase با عملیات سریع در طول لیز غیرفعال می شود.

2: روش استخراج مناسب برای بافت با محتوای ریبوزیم بالا انتخاب کنید و بافت چربی بهتر است از روش حاوی فنل استفاده کنید.

3: کیفیت پیش‌بینی به شمالی نیاز دارد، ساخت کتابخانه cDNA به یکپارچگی بالا نیاز دارد، و RT-PCR و RPA (آزمایش حفاظت ریبونوکلئاز) به یکپارچگی بالایی نیاز ندارند.RT-PCR به خلوص بالا (بقایای بازدارنده آنزیم) نیاز دارد.

4: همگن سازی کامل کلید بهبود عملکرد و کاهش تخریب است.

5: یکپارچگی تشخیص الکتروفورز RNA را بررسی کنید، 28S: 18S = 2: 1 یک علامت کامل است، 1: 1 نیز برای اکثر آزمایش ها قابل قبول است.

6: حذف DNA برای RT-PCR، تجزیه و تحلیل آرایه بهتر است از Dnase I برای حذف DNA استفاده شود.

7: کاهش آلودگی آنزیم های بیرونی – آنزیم ها را نمی توان از خارج وارد کرد.

8: هنگام تغلیظ اسید نوکلئیک با غلظت کم، معرف هم رسوبی باید اضافه شود.اما برای جلوگیری از رسوب همزمان حاوی آنزیم ها و آلودگی DNA.

9: RNA را کاملاً حل کنید، در صورت لزوم به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد حرارت دهید.

روش نگهداری مناسب

می توان آن را برای مدت کوتاهی در دمای -20 درجه سانتیگراد و برای مدت طولانی در -80 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.اولین قدم در بهبود بازده RNA این است که بدانیم محتوای RNA نمونه های مختلف بسیار متفاوت است.فراوانی بالا (4-2 میکروگرم بر میلی گرم) مانند کبد، لوزالمعده، قلب، فراوانی متوسط ​​(0.05-2 میکروگرم بر میلی گرم) مانند مغز، جنین، کلیه، ریه، تیموس، تخمدان، فراوانی کم (<0.05 میکروگرم بر میلی گرم) میلی گرم) مانند مثانه، استخوان، چربی.

1: سلول ها را لیز کنید تا RN آزاد شود - اگر RNA آزاد نشود، بازده کاهش می یابد.همگن‌سازی الکتریکی بهتر از سایر روش‌های همگن‌سازی کار می‌کند، اما ممکن است نیاز به ترکیب با روش‌های دیگر مانند له کردن نیتروژن مایع، هضم آنزیمی (Lysozyme/Lyticase) باشد.

2: بهینه سازی روش استخراج.بزرگترین مشکلات روش‌های مبتنی بر فنل، طبقه‌بندی ناقص و از دست دادن جزئی RNA است (روی‌ناتانت را نمی‌توان به طور کامل حذف کرد).طبقه بندی ناقص به دلیل محتوای بالای اسید نوکلئیک و پروتئین است که با افزایش مقدار لیزات مصرفی یا کاهش مقدار نمونه قابل حل است.مرحله ای از استخراج کلروفرم به بافت چربی اضافه شد.از دست دادن RNA را می توان با پمپاژ برگشتی یا با حذف لایه آلی و سپس سانتریفیوژ کاهش داد.بزرگترین مشکل روش های مبتنی بر سانتریفیوژ ستونی، نمونه اضافی است.

نکات استخراج کلاسیک

1. تصفیه فنل: به حجم مساوی 1:1 فنل/کلروفرم اضافه کنید و به مدت 1-2 دقیقه به شدت مخلوط کنید.با سرعت بالا به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.مایع رویی (80-90%) را با دقت خارج کنید.هرگز به لایه میانی نرسید.حجم مساوی از محلول واکنش را می توان به فنل/کلروفرم اضافه کرد و مایع رویی را حذف کرد.دو مایع رویی را می توان برای رسوب اسید نوکلئیک با هم مخلوط کرد تا عملکرد را بهبود بخشد.هنگام مخلوط کردن خیلی ملایم نباشید و سعی نکنید تمام مایع رویی را بردارید.

2. شستشو با اتانول 70-80 درصد: در حین شستشو، اسید نوکلئیک باید معلق شود تا از شستشوی نمک باقیمانده اطمینان حاصل شود.در همان زمان بلافاصله پس از ریختن اتانول، چند ثانیه با سرعت بالا سانتریفیوژ کنید و سپس اتانول باقیمانده را با پیپت خارج کنید.پس از ماندن در دمای اتاق به مدت 5-10 دقیقه حل کنید.

11. استخراج سازمان های خاص

1. بافت فیبری: کلید استخراج RNA از بافت فیبری مانند قلب/عضله اسکلتی، از هم گسیختگی کامل بافت است.این بافت ها تراکم سلولی کمی دارند، بنابراین مقدار RNA در واحد وزن بافت کم است و بهتر است تا حد امکان از مقدار اولیه استفاده شود.حتماً در شرایط انجماد بافت را کاملاً آسیاب کنید.

2. بافت هایی با محتوای پروتئین/چربی بالا: محتوای چربی مغز/گیاهی بالاست.پس از استخراج PCI، مایع رویی حاوی لخته های سفید است.مایع رویی باید دوباره با کلروفرم استخراج شود.

3. بافت هایی با محتوای اسید نوکلئیک/ریبوزیم بالا: طحال/ تیموس دارای محتوای اسید نوکلئیک و ریبوزیم بالایی است.آسیاب کردن بافت در شرایط انجماد و به دنبال همگن سازی سریع می تواند به طور موثر ریبوزیم ها را غیرفعال کند.با این حال، اگر lysate بیش از حد چسبناک باشد (به دلیل محتوای اسید نوکلئیک بالا)، استخراج PCI نمی تواند به طور موثر طبقه بندی شود.اضافه کردن lysate بیشتر می تواند این مشکل را حل کند.استخراج چندگانه PCI می تواند DNA باقیمانده بیشتری را حذف کند.اگر بلافاصله پس از افزودن الکل یک رسوب سفید تشکیل شود، نشان دهنده آلودگی DNA است.استخراج مجدد با PCI اسیدی پس از انحلال می تواند آلودگی DNA را حذف کند.

4. بافت گیاهی: بافت گیاهی پیچیده تر از بافت حیوانی است.به طور کلی، گیاهان تحت شرایط نیتروژن مایع آسیاب می شوند، بنابراین تجزیه RNA توسط آنزیم های درون زا غیر معمول است.اگر مشکل تخریب حل نشود، تقریباً به طور قطع ناشی از ناخالصی های موجود در نمونه است.ناخالصی‌های موجود در بسیاری از گیاهان منجر به باقی‌مانده‌ها می‌شوند و دلیل باقی‌مانده‌ها اغلب به این دلیل است که این ناخالصی‌ها شباهت‌هایی با RNA دارند: شما رسوب می‌کنید و من رسوب می‌کنم، و شما جذب می‌کنید و من جذب می‌کنم.این ویژگی ها نشان می دهد که آنها مهارکننده های آنزیمی بسیار قوی هستند.

در حال حاضر، معرف‌های استخراج RNA تجاری را می‌توان تقریباً با تمام بافت‌های حیوانی با تنظیمات کوچک تطبیق داد، اما معرف‌های استخراج RNA تجاری کمی وجود دارند که می‌توانند برای اکثر بافت‌های گیاهی مناسب باشند.خوشبختانه، Foregene می تواند موارد خاصی را ارائه دهدکیت های استخراج RNA گیاهی، ما داریمکیت جداسازی RNA توتال گیاهی, کیت جداسازی RNA توتال گیاهی پلاس.دومی مخصوص گیاهان با محتوای پلی ساکارید و پلی فنل بالا طراحی شده است.برای استخراج RNA، بازخورد کاربران آزمایشگاه به ویژه خوب است.

12. اثر انجماد و ذوب نمونه نمونه منجمد ممکن است بزرگتر باشد و قبل از استفاده برای استخراج RNA باید بریده شود.نمونه ها در طول برش تمایل دارند (احتمالاً تا حدی) ذوب شوند.نمونه های منجمد ممکن است نیاز به وزن کردن قبل از استخراج RNA داشته باشند و ذوب شدن قطعا در طی این فرآیند اتفاق می افتد.گاهی اوقات، ذوب نمونه نیز در طول فرآیند آسیاب نیتروژن مایع رخ می دهد.یا نمونه منجمد مستقیماً بدون آسیاب نیتروژن مایع به لیزات اضافه می شود و قطعاً قبل از همگن شدن کامل ذوب شدن اتفاق می افتد.آزمایشات نشان داده است که بافت یخ زده بیشتر از بافت تازه در معرض تخریب RNA در حین ذوب شدن است.دلیل احتمالی: فرآیند انجماد و ذوب ساختارهای درون سلول را مختل می کند و تماس مستقیم آنزیم های درون زا با RNA را آسان تر می کند.

13. قضاوت در مورد کیفیت RNA معمولاً از الکتروفورز برای قضاوت در مورد یکپارچگی RNA و A260/A280 برای قضاوت در مورد خلوص RNA استفاده می شود.در تئوری، RNA دست نخورده دارای نسبت 28S:18S = 2.7:1 است و بیشتر داده ها بر نسبت 28S:18S = 2:1 تاکید دارند.واقعیت این است که تقریبا هیچ یک از RNA استخراج شده از نمونه های دیگر به جز سلول ها در نسبت 2:1 نیست (این با استفاده از Bioanalyzer Agilent بدست آمد).

نتایج الکتروفورز RNA تحت تأثیر عوامل زیادی از جمله ساختار ثانویه، شرایط الکتروفورز، بار نمونه، درجه اشباع توسط EB و غیره است. از الکتروفورز طبیعی برای تشخیص RNA و استفاده از نشانگر DNA به عنوان کنترل استفاده کنید.اگر 28S در 2kb و 18S در 0.9kb واضح باشند، و 28S: 18S > 1، یکپارچگی می‌تواند الزامات اکثر آزمایش‌های بعدی را برآورده کند.

A260/A280 شاخصی است که ابهامات زیادی را ایجاد کرده است.اول از همه، لازم است معنای اصلی این شاخص برای اسیدهای نوکلئیک روشن شود: RNA خالص، A260/280 آن = حدود 2.0.RNA خالص "علت" و A260/A280 = 2 "اثر" است.اکنون همه از A260/A280 به عنوان یک "علت" استفاده می کنند، و فکر می کنند که "اگر A260/A280 = 2، پس RNA خالص است"، که به طور طبیعی منجر به سردرگمی می شود.

اگر علاقه مند هستید، می توانید یک معرف کوچک که اغلب در استخراج استفاده می شود، مانند فنل، ایزوتیوسیانات گوانیدین، PEG و غیره را به نمونه RNA خود اضافه کنید و سپس نسبت A260/A280 را اندازه گیری کنید.واقعیت این است که بسیاری از معرف‌های مورد استفاده برای استخراج RNA، و همچنین بسیاری از ناخالصی‌های موجود در نمونه، حدود A260 و A280 را جذب می‌کنند و بر A260/A280 تأثیر می‌گذارند.

آموزنده ترین رویکرد در حال حاضر اسکن نمونه های RNA در محدوده 200-300 نانومتر است.منحنی RNA خالص دارای ویژگی های زیر است: منحنی صاف است، A230 و A260 دو نقطه عطف هستند، A300 نزدیک به 0، A260/A280 = حدود 2.0، و A260/A230 = حدود 2.0 است.اگر داده‌های اسکن در دسترس نباشند، نسبت A260/A230 نیز باید تعیین شود، زیرا این نسبت به انتقال همه ناخالصی‌هایی که بر واکنش آنزیمی تأثیر می‌گذارند حساس‌تر است.محدوده خطی دستگاه (0.1-0.5 برای A260) را در نظر بگیرید.

دو پدیده مفید دیگر وجود دارد: زمانی که A260/A280 در آب اندازه گیری شود، نسبت 0.3 کمتر خواهد بود.در حالی که نسبت اندازه گیری شده در 10 میلی مولار EDTA حدود 0.2 بیشتر از نسبت اندازه گیری شده در EDTA 1 میلی مولار است.

محصولات مرتبط:

تولید کننده و تامین کننده کیت جداسازی RNA توتال گیاهی چین |Foregene (foreivd.com)

سری جداسازی RNA تامین کنندگان و کارخانه |تولیدکنندگان سری جداسازی RNA چین (foreivd.com)

سری جداسازی RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)