به خوبی شناخته شده است که در جزم مرکزی، RNA واسطه رونویسی بین بیان DNA و پروتئین است.در مقایسه با تشخیص DNA، تشخیص RNA می تواند به طور عینی تری بیان ژن را در موجودات منعکس کند.آزمایش‌های مربوط به RNA عبارتند از: qRT-PCR، RNA-Seq، و تشخیص ژن فیوژن و غیره. بر اساس ویژگی‌های خود RNA (حلقه قندی RNA یک گروه هیدروکسیل آزادتر از حلقه قند DNA دارد)، همراه با تعداد زیادی RNase در محیط، RNA ناپایدارتر است و تجزیه آن راحت‌تر از DNA است.زباله در داخل، زباله بیرون، اگر کیفیت RNA خوب نیست، نتایج تجربی باید رضایت بخش نباشد، به طور خاص به عنوان داده های نادرست یا تکرارپذیری ضعیف آشکار می شود.بنابراین، باید به پردازش RNA توجه بیشتری شود و پیوند کنترل کیفیت نیز برای اطمینان از دقت و صحت داده‌های آزمایشی بعدی مهم‌تر است.

برای کنترل کیفیت RNA، معمولاً از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

• اسپکتروفتومتری
• الکتروفورز ژل آگارز
• بیوانالایزر چابک
• PCR کمی فلورسنت بلادرنگ
• روش رنگ فلورسنت کیوبیت

01 اسپکتروفتومتری

RNA دارای پیوندهای دوگانه مزدوج است و پیک جذب در طول موج 260 نانومتر دارد.طبق قانون لامبرت-بیر، می‌توانیم غلظت RNA را از پیک جذب در 260 نانومتر محاسبه کنیم.علاوه بر این، ما همچنین می توانیم خلوص RNA را با توجه به نسبت پیک های جذب 260 نانومتر، 280 نانومتر و 230 نانومتر محاسبه کنیم.280 نانومتر و 230 نانومتر به ترتیب پیک جذب پروتئین ها و مولکول های کوچک هستند.نسبت A260/A280 و A260/A230 خلوص RNA واجد شرایط باید بیشتر از 2 باشد. اگر کمتر از 2 باشد، به این معنی است که در نمونه RNA پروتئین یا آلودگی مولکولی کوچک وجود دارد و باید دوباره خالص شود.منابع آلودگی بر آزمایش‌های پایین‌دستی تأثیر می‌گذارد، مانند مهار بازده تقویت واکنش‌های PCR، که منجر به نتایج کمی نادرست می‌شود.خلوص RNA تأثیر زیادی بر نتایج بعدی دارد، بنابراین اسپکتروفتومتری به طور کلی یک پیوند کنترل کیفیت ضروری در اولین مرحله در آزمایش‌های اسید نوکلئیک است.

شکل 1. طیف جذبی معمولی RNA/DNA

02 الکتروفورز ژل آگارز

علاوه بر خلوص، یکپارچگی RNA نیز یکی از شاخص های مهم برای قضاوت در مورد کیفیت RNA است.تخریب RNA منجر به تعداد زیادی قطعات کوتاه در نمونه می شود، بنابراین تعداد قطعات RNA که می توانند به طور موثر شناسایی شوند و توسط توالی مرجع پوشش داده شوند کاهش می یابد.یکپارچگی RNA را می توان با الکتروفورز RNA کل روی ژل آگارز 1% بررسی کرد.این روش می تواند ژل را خودتان پیکربندی کند، یا از سیستم E-Gel™ پیش ساخته برای تست یکپارچگی استفاده کند.بیش از 80 درصد از کل RNA RNA ریبوزومی است که اکثریت آن از 28S و 18S rRNA (در سیستم های پستانداران) تشکیل شده است.RNA با کیفیت خوب دو میله روشن واضح را نشان می دهد که به ترتیب میله های روشن 28S و 18S هستند، در 5 Kb و 2 Kb، و نسبت نزدیک به 2:1 خواهد بود.اگر در حالت انتشار باشد، به این معنی است که نمونه RNA ممکن است تجزیه شده باشد، و توصیه می شود از روشی که بعدا توضیح داده شد برای آزمایش بیشتر کیفیت RNA استفاده کنید.

شکل 2. مقایسه RNA تخریب شده (خط 2) و دست نخورده (خط 3) در الکتروفورز ژل آگارز

03 بیوانالایزر چابک

علاوه بر روش الکتروفورز ژل آگارز که در بالا توضیح داده شد، که می تواند به ما کمک کند یکپارچگی RNA را به سادگی و سریع شناسایی کنیم، می توانیم از بیوانالایزر Agilent نیز برای تعیین یکپارچگی RNA استفاده کنیم.از ترکیبی از میکروسیال ها، الکتروفورز مویرگی و فلورسانس برای ارزیابی غلظت و یکپارچگی RNA استفاده می کند.با استفاده از الگوریتم داخلی برای تجزیه و تحلیل مشخصات نمونه RNA، بیوانالایزر Agilent می تواند یک مقدار یکپارچگی RNA مرجع، شماره یکپارچگی RNA (که از این پس RIN نامیده می شود) محاسبه کند [1].هرچه مقدار RIN بزرگتر باشد، یکپارچگی RNA بالاتر است (1 بسیار تخریب شده، 10 کاملترین است).برخی از آزمایش‌های مربوط به RNA استفاده از RIN را به عنوان پارامتری برای ارزیابی کیفیت پیشنهاد می‌کنند.با در نظر گرفتن آزمایش‌های توالی‌یابی با توان بالا (از این پس به عنوان NGS نامیده می‌شود)، دستورالعمل‌های Oncomine™ Human Immune Repertoire، که برای شناسایی گیرنده‌های آنتی‌ژن سلول B و سلول T در سری پانل Oncomine Thermo Fisher استفاده می‌شود، نشان می‌دهد که نمونه‌هایی با مقادیر RIN بزرگتر از 4 می‌توانند اندازه‌گیری شوند (شکل‌های موثرتر را می‌توان اندازه‌گیری کرد).محدوده های پیشنهادی متفاوتی برای پانل های مختلف وجود دارد و اغلب RIN بالاتر می تواند داده های موثرتری را به ارمغان آورد.

شکل 3، در آزمایش‌های Oncomine™ Human Immune Repertoire، نمونه‌هایی با RIN بیشتر از 4 می‌توانند قرائت‌های موثرتر و کلون‌های سلول T را شناسایی کنند.【2】

با این حال، مقدار RIN نیز محدودیت هایی دارد.اگرچه RIN همبستگی بالایی با کیفیت داده های تجربی NGS دارد، اما برای نمونه های FFPE مناسب نیست.نمونه‌های FFPE برای مدت طولانی تحت درمان شیمیایی قرار گرفته‌اند و RNA استخراج‌شده عموماً دارای مقدار RIN نسبتاً پایینی است.با این حال، این بدان معنا نیست که داده های موثر آزمایش باید رضایت بخش نباشد.برای ارزیابی دقیق کیفیت نمونه های FFPE، باید از اندازه گیری هایی غیر از RIN استفاده کنیم.علاوه بر RIN، بیوانالایزر Agilent می تواند مقدار DV200 را به عنوان پارامتر ارزیابی کیفیت RNA نیز محاسبه کند.DV200 پارامتری است که نسبت قطعات بزرگتر از 200 جفت باز را در یک نمونه RNA محاسبه می کند.DV200 شاخص بهتری برای کیفیت نمونه FFPE نسبت به RIN است.برای RNA استخراج شده توسط FFPE، همبستگی بسیار بالایی با تعداد ژن هایی که می توان به طور موثر تشخیص داد و تنوع ژن ها دارد [3].اگرچه DV200 می تواند کمبودهای موجود در تشخیص کیفیت FFPE را جبران کند، بیوانالایزر Agilent هنوز نمی تواند به طور جامع مشکلات کیفیت در نمونه های RNA را تجزیه و تحلیل کند، از جمله اینکه آیا بازدارنده هایی در نمونه ها وجود دارد یا خیر.خود بازدارنده‌ها می‌توانند بر راندمان تقویت آزمایش‌های پایین‌دست تأثیر بگذارند و میزان داده‌های مفید را کاهش دهند.برای دانستن اینکه آیا یک بازدارنده در نمونه وجود دارد، می‌توانیم روش PCR کمی فلورسنت را که در ادامه توضیح داده می‌شود، اتخاذ کنیم.

04 PCR کمی فلورسنت بلادرنگ

روش Real-time فلورسنت کمی PCR نه تنها می تواند بازدارنده های موجود در نمونه را شناسایی کند، بلکه کیفیت RNA در نمونه FFPE را نیز به طور دقیق منعکس می کند.در مقایسه با آنالایزرهای بیولوژیکی Agilent، ابزارهای کمی فلورسانس بلادرنگ به دلیل کاربرد وسیع‌تر، در آزمایشگاه‌های اصلی بیولوژیکی محبوب‌تر هستند.برای آزمایش کیفیت نمونه‌های RNA، فقط باید پروب‌های پرایمری برای ژن‌های مرجع داخلی مانند GUSB (Cat No. Hs00939627) خریداری یا آماده کنیم.با استفاده از این مجموعه از آغازگرها، پروب ها و استانداردها (RNA کل با غلظت شناخته شده) برای انجام آزمایش های کمی مطلق، می توان غلظت موثر قطعه RNA را به عنوان استاندارد ارزیابی کیفیت RNA (به اختصار Functional RNA Quantitation (FRQ) محاسبه کرد.در یک آزمایش NGS، ما دریافتیم که FRQ نمونه‌های RNA همبستگی بسیار بالایی با حجم داده‌های موثر دارد.برای همه نمونه‌های بزرگ‌تر از 0.2ng/uL FRQ، حداقل 70 درصد قرائت‌ها می‌توانند به طور موثر توالی مرجع را پوشش دهند (شکل 4).

شکل 4، مقدار FRQ شناسایی شده با روش کمی فلورسانس دارای همبستگی بسیار بالایی است (R2>0.9) با داده های موثر به دست آمده در آزمایش NGS.خط قرمز مقدار FRQ برابر با 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) است.【4】

روش PCR کمی، علاوه بر قابل اجرا بودن در نمونه‌های FFPE، می‌تواند به طور موثر مهارکننده‌های موجود در نمونه‌ها را پایش کند.می‌توانیم نمونه‌ای را که قرار است شناسایی شود با کنترل مثبت داخلی (IPC) و سنجش آن به سیستم واکنش اضافه کنیم و سپس برای به دست آوردن مقدار Ct، کمی‌سازی فلورسانس را انجام دهیم.اگر مقدار Ct از مقدار Ct در واکنش بدون نمونه عقب بماند، نشان دهنده وجود بازدارنده در نمونه است و بازده تقویت در واکنش را مهار می کند.

05 روش رنگ فلورسنت کیوبیت

فلورومتر کیوبیت رایج ترین دستگاه کوچک مورد استفاده برای تشخیص غلظت و خلوص اسید نوکلئیک است که کار با آن آسان است و تقریباً در هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی وجود دارد.غلظت اسید نوکلئیک را با تشخیص و رنگ فلورسنت متصل شونده به اسید نوکلئیک (معرف تشخیص کوبیت) به دقت محاسبه می کند.کیوبیت حساسیت و ویژگی بالایی دارد و می‌تواند RNA را تا غلظت pg/μL کمیت کند.علاوه بر توانایی شناخته شده برای تعیین کمیت غلظت اسید نوکلئیک، آخرین مدل جدید ترمو فیشر، کیوبیت 4.0، می تواند یکپارچگی RNA را نیز تشخیص دهد.سیستم تشخیص RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) یکپارچگی RNA را با تشخیص همزمان دو رنگ فلورسنت خاص تشخیص می دهد.این دو رنگ فلورسنت می توانند به ترتیب به قطعات بزرگ و قطعات کوچک RNA متصل شوند.این دو رنگ فلورسنت نسبت قطعات بزرگ RNA را در نمونه نشان می دهند و از این طریق مقدار IQ (Integrity و Quality) که نشان دهنده کیفیت RNA است را می توان محاسبه کرد.مقدار IQ برای هر دو نمونه FFPE و غیر FFPE قابل اعمال است و تأثیر زیادی بر کیفیت توالی بعدی دارد.با در نظر گرفتن آزمایش‌های NGS به عنوان مثال، در آزمایش‌های آزمایشی RNA-Seq که بر روی پلتفرم Ion torrent™ انجام شد، اکثر نمونه‌هایی با مقادیر IQ بیشتر از 4 حداقل 50٪ خواندن مؤثر داشتند (شکل 5).در مقایسه با روش‌های تشخیص فوق‌الذکر، Qubit IQ Assay نه تنها برای کار راحت‌تر است و زمان کمتری (در عرض پنج دقیقه) می‌گیرد، بلکه همبستگی زیادی بین مقدار IQ پارامتر اندازه‌گیری شده و کیفیت داده‌های آزمایش‌های پایین‌دستی دارد.

شکل 5، همبستگی زیادی بین مقدار Qubit RNA IQ و خوانش های نقشه برداری شده RNA-Seq وجود دارد.【5】

از طریق مقدمه بالا، من معتقدم که همه درک کافی از روش های مختلف کنترل کیفیت RNA دارند.در عمل می توانید انتخاب کنیدروش مربوطه با توجه به نوع نمونه و ابزار موجود.تنها با کنترل خوب کیفیت RNA می‌توان از شکست آزمایش‌های بعدی ناشی از کیفیت پایین نمونه جلوگیری کرد و در نتیجه در زمان، انرژی و هزینه گرانبها صرفه‌جویی کرد.

محصولات مرجع:

کیت جداسازی RNA توتال حیوانات

کیت جداسازی RNA توتال سلولی

منابع

【1】 شرودر، آ.، مولر، او.، استوکر، اس. و همکاران.RIN: یک عدد یکپارچگی RNA برای تخصیص مقادیر یکپارچگی به اندازه‌گیری‌های RNA.BMC Molecular Biol 7، 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】راهنمای کاربر Oncomine Human Immune Repertoire (شماره انتشارات MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas، Charles E Wood، Brian N Chorley، Carole L Yauk، Gail M Nelson، Susan D Hester، معیارهای کیفیت بهبودیافته برای ارزیابی RNA مشتق شده از نمونه‌های بافتی بایگانی شده با پارافین تثبیت‌شده با فرمالین، علوم سم‌شناسی، آگوست 2، 2، 170، 57-373،https://doi.org/10.1093/toxsci/