ما تولید کننده با تجربه بوده ایم.کسب اکثریت در گواهینامه های حیاتی بازار خود برای کاوشگر تک مرحله ای با حساسیت بالا چین با تخفیف بزرگQpcrکیت V2، کیفیت زندگی کارخانه است، تمرکز بر تقاضای مشتری منبع بقا و توسعه شرکت است، ما به صداقت و حسن نیت کاری پایبند هستیم، منتظر آمدن شما هستیم!
ما تولید کننده با تجربه بوده ایم.کسب اکثریت در گواهینامه های حیاتی بازار خود برایچین تاک DNA پلیمراز, Qpcr، شرکت ما قول می دهد: قیمت های مناسب، زمان تولید کوتاه و خدمات پس از فروش رضایت بخش، ما همچنین از شما استقبال می کنیم که در هر زمانی که بخواهید از کارخانه ما دیدن کنید.ای کاش اکنون یک تجارت دلپذیر و طولانی مدت با هم داشته باشیم!!!

توضیحات

این کیت از یک سیستم بافر لیز منحصربه‌فرد استفاده می‌کند که می‌تواند به سرعت RNA را از نمونه‌های سلولی کشت‌شده برای واکنش‌های RT-qPCR آزاد کند و در نتیجه فرآیند خالص‌سازی RNA زمان‌بر و پر زحمت را حذف کند.الگوی RNA را می توان تنها در 7 دقیقه به دست آورد.معرف های 5×Direct RT Mix و 2×Direct qPCR Mix-SYBR ارائه شده توسط کیت می توانند به سرعت و به طور موثر نتایج کمی PCR را در زمان واقعی بدست آورند.

5×Direct RT Mix و 2×Direct qPCR Mix-SYBR دارای تحمل بازدارنده قوی هستند و lysate نمونه ها را می توان به عنوان الگوی مستقیم برای RT-qPCR استفاده کرد.این کیت حاوی RNA منحصر به فرد با میل ترکیبی بالا Foregene رونوشت معکوس، و Hot D-Taq DNA پلیمراز، dNTPs، MgCl است.₂بافر واکنش، بهینه ساز و تثبیت کننده PCR.

مشخصات فنی

200×20μl Rxns، 1000×20μl Rxns

اجزای کیت

ویژگی ها و مزایا

■ ساده و موثر: با فناوری Cell Direct RT، نمونه های RNA را می توان تنها در 7 دقیقه به دست آورد.

■ تقاضای نمونه کم است، تا 10 سلول را می توان آزمایش کرد.

■ توان عملیاتی بالا: می تواند به سرعت RNA را در سلول های کشت شده در صفحات 384، 96، 24، 12، 6 چاهی تشخیص دهد.

■ پاک‌کن DNA می‌تواند ژنوم‌های آزاد شده را به سرعت حذف کند و تأثیر آن بر نتایج آزمایشی بعدی را تا حد زیادی کاهش دهد.

■ سیستم RT و qPCR بهینه شده، رونویسی معکوس دو مرحله ای RT-PCR را کارآمدتر و PCR را خاص تر و در برابر مهارکننده های واکنش RT-qPCR مقاوم تر می کند.

اپلیکیشن کیت

دامنه کاربرد: سلول های کشت شده.

- RNA منتشر شده توسط لیز نمونه: فقط برای الگوی RT-qPCR این کیت قابل استفاده است.

- کیت را می توان برای اهداف زیر استفاده کرد: تجزیه و تحلیل بیان ژن، تأیید اثر خاموشی ژن با واسطه siRNA، غربالگری دارو و غیره.

نمودار

ذخیره سازی و ماندگاری

قسمت اول این کیت باید در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود.قسمت دوم باید در دمای -20 درجه سانتیگراد ذخیره شود.

Foregene Protease Plus II باید در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود، در دمای -20 درجه سانتیگراد منجمد نشود.

معرف 2×Direct qPCR Mix-SYBR باید در دمای -20 درجه سانتیگراد در تاریکی ذخیره شود.در صورت استفاده مکرر، می توان آن را در دمای 4 درجه سانتیگراد برای ذخیره سازی کوتاه مدت (در مدت 10 روز استفاده کنید) ذخیره کرد. ما سازنده با تجربه هستیم.کسب اکثریت در گواهینامه های مهم بازار خود برای تخفیف بزرگ چین با حساسیت بالا کیت Rt-Qpcr V2، کیفیت زندگی کارخانه است، تمرکز بر تقاضای مشتری منبع بقا و توسعه شرکت است، ما به صداقت و نگرش کاری خوب پایبند هستیم، منتظر آمدن شما هستیم!
تخفیف بزرگچین تاک DNA پلیمراز، Qpcr، شرکت ما قول می دهد: قیمت های مناسب، زمان تولید کوتاه و خدمات پس از فروش رضایت بخش، ما همچنین از شما استقبال می کنیم که در هر زمانی که بخواهید از کارخانه ما دیدن کنید.ای کاش اکنون یک تجارت دلپذیر و طولانی مدت با هم داشته باشیم!!!

QuickEآسیTM Cell Direct RT-qPCR Kit -تقمan

Cat.No.DRT-01021/01022

برای سلول مستقیم RT-qPCR با استفاده از ≤ 1000000 سلول

معرفی محصول

این محصول از یک سیستم بافر لیز منحصربه‌فرد برای آزادسازی سریع RNA از نمونه‌های سلولی کشت‌شده برای واکنش‌های RT-qPCR استفاده می‌کند، فرآیند تصفیه RNA زمان‌بر و پر زحمت را حذف می‌کند و تنها 7 دقیقه برای به دست آوردن الگوی RNA مورد نیاز، با مخلوط 5× Direct RT، 2× Direct qPCR Mix-Taqman می‌تواند به سرعت و به‌طور واقعی نتایج کمی را به دست آورد.

5× Direct RT Mix و 2× Direct qPCR Mix-Taqman دارای تحمل بازدارنده قوی هستند و می توانند با استفاده از لیز نمونه اندازه گیری شده به عنوان یک الگو، برگشت کارآمد و تقویت خاص را انجام دهند.این معرف حاوی ترانس کریپتاز معکوس Foregene، DNA پلیمراز داغ D-Taq، dNTPs، MgCl است.₂بافر واکنش، بهینه ساز PCR و تثبیت کننده، که می تواند با بافر لیز برای تشخیص سریع و آسان نمونه ها استفاده شود و دارای ویژگی های حساسیت، ویژگی و پایداری بالا است.

مشخصات محصول

فناوری ساده و موثر Cell Direct RT که تنها ۷ دقیقه طول می کشد تا نمونه های RNA را دریافت کنید.

نمونه مورد نیاز کوچک است و حداقل از 10 سلول کشت شده می توان برای آزمایش استفاده کرد.

توان عملیاتی بالا برای جذب سریع RNA سلول های کشت شده مانند صفحات 384، 96، 24، 12 و 6 چاهی.

پاک کن DNA قادر است ژنوم های آزاد شده را به سرعت حذف کند و تأثیر آن بر نتایج آزمایش بعدی را تا حد زیادی کاهش دهد.

سیستم‌های RT و qPCR بهینه‌شده، RT-PCR دو مرحله‌ای را با رونویسی معکوس کارآمدتر، ویژگی و تحمل قوی‌تر مهارکننده واکنش RT-qPCR امکان‌پذیر می‌کنند.

اپلیکیشن کیت

دامنه کاربرد: سلول های کشت شده.

RNA تفسیر شده لیز نمونه: فقط به عنوان یک الگوی RT-qPCR دو مرحله ای استفاده می شود.

کیت ها را می توان برای اهداف زیر استفاده کرد: تجزیه و تحلیل بیان تنظیم کننده ژن، آزمایش آلل، غربالگری دارو و غیره.

محدودیت های کیت

قطعات تقویت شده ≤ 300 جفت باز.

کیت ها برای کشت تازه سلول ها استفاده می شوند.

کنترل کیفیت محصول

بر اساس سیستم مدیریت کیفیت جامع FOREGENE، هر دسته از کیت های سری Cell Direct RT-qPCR چندین بار به شدت آزمایش می شود تا از قابلیت اطمینان و ثبات کیفیت هر دسته از کیت ها اطمینان حاصل شود.

محتویات کیت

*:Cell Lysis، 5×Direct RT Mix، 2× Direct qPCR Mix-Taqman را می توان به طور جداگانه خریداری کرد، جزئیات در پیوست 1 ارائه شده است (صفحه 13).

شرایط نگهداری

1. شرایط حمل و نقل

کل فرآیند حمل و نقل جعبه بسته یخ با دمای پایین، برای اطمینان از اینکه کیت در حالت <4 درجه سانتیگراد قرار دارد.

2. شرایط نگهداری

قسمت I را در دمای 4 درجه سانتیگراد و قسمت دوم را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

Foregene Protease Plus II باید در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود، نه در دمای -20 درجه سانتیگراد منجمد شود.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman در -20 درجه سانتیگراد یا در 4 درجه سانتیگراد برای استفاده کوتاه مدت در صورت استفاده مکرر (در عرض 10 روز) نگهداری می شود.

اطلاعات اجزای کیت

بافر CL: محیط مورد نیاز برای واکنش های لیز سلولی را فراهم می کند.

بافر ST: ماده فعال موجود در لیز را خاتمه می دهد تا از تأثیرات روی RT بعدی جلوگیری کند.

پاک کن DNA: حذف کننده DNA، اثر حذف ژنوم در آزمایش های بعدی.

5× Direct RT Mix: حاوی ترانس کریپتاز معکوس Foregene با میل ترکیبی بالا، بازدارنده RNase، dNTPs، تثبیت کننده ها، تقویت کننده ها، بهینه سازها و آغازگرهای رونویسی معکوس برای تراز بهینه (Random Primer، Oligo(dT)₁₈آغازگر).

Foregene Protease Plus II: در زمینه بافر لیز، سلول ها برای آزادسازی اسیدهای نوکلئیک لیز می شوند.

2× مستقیم qPCR Mix-Taqman: این معرف حاوی Hot D-Taq DNA Polymerase، dNTPs، MgCl است.₂بافر واکنش، بهینه ساز PCR و تثبیت کننده.

رنگ مرجع 20× ROX: عموماً در ابزارهای تقویت Real Time PCR شرکت های ABI، Stratagene و سایر شرکت ها، برای تنظیم تفاوت بین لوله های PCR و لوله های ناشی از خطاهای دوز PCR استفاده می شود.غلظت رنگ مرجع 20× ROX مورد نیاز برای ابزارهای مختلف متفاوت است و کاربر می تواند آن را با توجه به غلظت توصیه شده دستگاه اضافه کند.

ddH بدون RNase₂O: آب فوق خالص استریل شده بدون RNase برای واکنش های دو مرحله ای RT-qPCR.

موارد احتیاط:(قبل از استفاده از کیت حتما نکات احتیاطی را به دقت بخوانید)

برای جلوگیری از آلودگی متقاطع بین نمونه ها به روش عملیات آزمایش توجه کنید.

به تمیزی محیط و ظروف آزمایشی توجه کنید تا از آلودگی RNase و تخریب RNA جلوگیری شود.

نمونه های سلولی تازه یا به خوبی نگهداری شده بردارید و هرگز از نمونه های سلولی منجمد و ذوب مکرر استفاده نکنید.

5× مستقیم qPCR Mix، 2× مستقیم qPCR Mix-Taqman باید از انجماد و ذوب مکرر جلوگیری کند، در غیر این صورت بر رونویسی معکوس و کارایی PCR تأثیر می گذارد.

آماده کنجیرهقبل ازعمل

قبل از استفاده از این کیت حتما دستورالعمل ها را به دقت بخوانید.کیت Cell Direct RT-qPCR ساده، راحت و سریع کار می کند و دستورالعمل ها اطلاعات کاملی در مورد کل کیت و نحوه استفاده صحیح از آن ارائه می دهند.لطفا قبل از استفاده مواد و تجهیزات آزمایشی لازم را آماده کنید.

مواد و تجهیزات آزمایشی

◆ سلول های کشت.

◆ 1.5 میلی لیتر یا 2 میلی لیتر، لوله سانتریفیوژ بدون RNase/DNase، نوک بدون RNase/DNase، لوله qPCR استریل 0.2 میلی لیتر.

◆ دستگاه qPCR، پیپت، سانتریفیوژ رومیزی (≥13,400×ز) (بسته به نیازهای تجربی) و غیره.

ایمنی

◆ این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی علمی است، لطفا از آن برای اهداف دارویی، بالینی، غذایی و آرایشی استفاده نکنید.

◆ هنگام استفاده از مواد شیمیایی، لباس آزمایشگاهی مناسب، دستکش، عینک محافظ و غیره بپوشید.

عملراهنماها

برای جزئیات در ضمیمه 1 (صفحه 13) می توان سیستم های سلول لیزیس، سیستم های RT و بسته های مکمل محلول واکنش qPCR را به طور جداگانه خریداری کرد.

راهنمای عملیات

پاسخ: انتشار نمونه RNA

1. سلول ها از قبل تیمار شدند: صفحه کشت سلولی را با PBS سرد بشویید، سپس سلول ها را لیز کنید (10-10⁶) 10⁶ برای استخراج و خالص سازی RNA، Foregene the Cell and RNA Isolation Kit The Total (DE-03111) یا Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) توصیه می شود.

1.1.سلول های چسبنده (صفحه 24 چاهی به عنوان مثال)

1.1.1.تعداد سلول ها را در هر چاه تعیین کنید، تعیین کنید که تعداد سلول ها 1 × 10 باشد⁵و از یک پیپت برای خارج کردن محیط کشت از ظرف کشت استفاده کنید.

1.1.2.200 میکرولیتر 1 × PBS از قبل سرد شده را به هر چاهک اضافه کنید.پیپت های مکرر را انجام ندهید و PBS را از چاه ها خارج کنید.صفحه را کج کنید و تا حد امکان PBS را بردارید.به مرحله 2 بروید.

1.1.3.ظرف کشت سلولی مختلف یا جدول شماره مرجع 1-1 در یک ظرف کشت سلولی از قبل خنک شده 1 × PBS برای شستشوی سلول اضافه شد.

جدول 1-1: دوز PBS برای تعداد مختلف سلول

توجه داشته باشید：برای اطمینان از یک سلول چسبنده محکم،هنگام شستشو از تعداد زیادی از دست دادن سلول جلوگیری می شود.

1.2.سلول های سوسپانسیون یا سلول های چسبنده در صفحات غیر متخلخل کشت می شوند

1.2.1.سلول‌های چسبنده که در صفحات غیرچند چاهی کشت می‌شوند (سلول‌های تعلیق از مرحله بعدی 1.2.2 شروع می‌شوند)، سلول‌ها را طبق روش جمع‌آوری سلولی معمولی جمع‌آوری و جدا می‌کنند و آنها را در یک صفحه کشت یا لوله سانتریفیوژ قرار می‌دهند.در صورت استفاده از تریپسینیزاسیون، نیاز به سانتریفیوژ برای جمع‌آوری سلول‌ها و حذف تریپسین باقی‌مانده، سلول‌های معلق مجدد PBS به سلول‌های جداگانه برای پراکندگی سلول‌ها اضافه شده است.

1.2.2.پس از تعداد سلول های شمارش شده، سلول ها 10×1 تقسیم شدند⁵ برای سانتریفیوژ کردن لوله ها، سلول ها را با سانتریفیوژ در 1000 × گرم به مدت 10 دقیقه جمع آوری کنید.

1.2.3.200 میکرولیتر PBS را به لوله سانتریفیوژ اضافه کنید، به طور مکرر پیپت نکنید و مستقیماً PBS را آسپیره کنید.به مرحله 2 ادامه دهید. (اگر رسوب دادن مشکل بود و سلول ها مجدداً معلق شدند، ممکن است 1000 × گرم سانتریفیوژ شده را 10 دقیقه پس از دور انداختن مایع رویی انجام دهید، گلوله سلولی به مرحله 2 بروید)

2. لیز سلولی: بافر CL را که دمای آن با دمای اتاق متعادل شده است، پاک کن DNA و پروتئاز پلاس II Foregene را طبق جدول زیر 1-2 حذف کنید: (محلول لیز آماده استفاده است).

جدول 1-2: رخ آماده سازی سیستم (توجه: در آماده سازی روی یخ)

3. (صفحه 24 چاهی به عنوان مثال) 200 میکرولیتر از مخلوط اصلی لیز سلولی را در هر چاه پیپت کنید، 5-10 بار مکرر باد کنید، در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) به مدت 5 دقیقه انکوبه کنید.

توجه داشته باشید：برای جلوگیری از تشکیل حباب، لطفاً هنگام پیپت کردن مقیاس پیپت تا 200 میکرولیتر یا کمتر تنظیم شود.سلول ها ممکن است پس از لیز کدر به نظر برسند که طبیعی است.

4. (صفحه 24 چاهی به عنوان مثال) به مایع 20 میکرولیتری بافر ST اضافه می شود (سیستم های لیز مختلف بافر ST به مقدار نشان داده شده در جدول 1-3 اضافه شده است)، پیپت کردن 5-10 بار تکرار شد، در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) به مدت 2 دقیقه انکوبه شد.

توجه داشته باشید：نوک پیپت در زیر سطح قرار می گیرد و اطمینان حاصل می کند که لیزات اضافه شده است،برای جلوگیری از تشکیل حباب، لطفاً هنگام پیپت کردن مقیاس پیپت تا 200 میکرولیتر یا کمتر تنظیم شود.

جدول 1-3：بافر ST را اضافه کنید

5. lysate برای آزمایش های بعدی RT-qPCR استفاده می شود.اگر آزمایش‌های بعدی را نمی‌توان به موقع انجام داد، لطفاً آن را بیش از 2 ساعت روی یخ نگه دارید و در دمای -20 یا -80 درجه سانتیگراد (بیش از سه ماه) نگهداری کنید.

ب: آماده سازی سیستم RT

1. مخلوط 5 × Direct RT را بیرون بیاورید و روی یک حمام یخ قرار دهید، بگذارید به طور طبیعی ذوب شود و به آرامی آن را برای استفاده بعدی مخلوط کنید.ddH2O بدون RNase را خارج کرده و ذوب کرده و برای استفاده بعدی روی حمام یخ قرار دهید.سیستم واکنش را بر روی یخ مطابق جدول 2-1 زیر آماده کنید.

جدول 2-1: آماده سازی سیستم واکنش RT

2. پس از تکمیل فرمول سیستم، به آرامی مخلوط و سانتریفیوژ شده در جدول زیر 2 -2 شرایط واکنش واکنش RT.

جدول 2-2: تنظیم شرایط واکنش RT

3. پس از اتمام واکنش، محصول واکنش مستقیماً برای qPCR روی یخ قرار داده شد، لطفاً نگهداری طولانی مدت -20 ℃ یا -80 ℃ را قرار دهید.

توجه: به دلیل استفاده از الگوی خالص نشده، ممکن است رسوبات سفید رنگ در محصول رونویسی معکوس ظاهر شود.این یک پدیده طبیعی است.برای آزمایش های بعدی، مایع رویی را فورا سانتریفیوژ کنید.

محلول واکنش RT به دست آمده به سیستم‌های واکنش سریع مرحله بعدی PCR اضافه می‌شود، توصیه می‌شود مقادیری از 10 تا 30 درصد سیستم واکنش را اضافه کنید.

ج: آماده سازی سیستم واکنش qPCR

1-مقدار مناسب B تهیه شده در قالب cDNA مرحله ای مطابق جدول 3-1 زیر برای تهیه سیستم واکنش.

توجه: مقدار قالب cDNA 10-30 درصد از سیستم qPCR را تشکیل می دهد.به عنوان مثال، در یک سیستم qPCR 20 میکرولیتری، 2-6 میکرولیتر بافر لیز اضافه کنید، اما نه بیشتر از 6 میکرولیتر.

2. بهینه سازی شرایط خوب qPCR (دمای بازپخت، و غیره) برای واکنش qPCR (شرایط واکنش ارائه شده در جدول 3-2).

توجه: سعی کنید از شرایط بهینه برای واکنش های qPCR استفاده کنید تا نتایج بهتری بگیرید.

جدول 3-1: تهیه سیستم واکنش PCR

1*: هنگامی که عملکرد واکنش پرایمر ضعیف است، غلظت پرایمر را می توان در محدوده 50-900 نانومولار تنظیم کرد.

توجه: سیستم qPCR را می توان با توجه به نیازهای تجربی و مدل چرخش فلورسانس تنظیم کرد.برای qPCR در 50μسیستم l، دوز معرف را متناسب با 20 تنظیم کنیدμl سیستم

2*: غلظت نهایی مناسب رنگ مرجع ROX را با توجه به سیکلر حرارتی کمی فلورسانس انتخاب کنید.مناسب ترین غلظت رنگ مرجع ROX برای سیکلرهای کمی فلورسانس رایج در جدول زیر نشان داده شده است:

جدول 3-2: شرایط واکنش qPCR ارائه شده است

توجه: برای به دست آوردن بهترین اثر qPCR، گرادیان PCR می تواند برای بهینه سازی شرایط واکنش برای قالب های مختلف و پرایمرهای مختلف استفاده شود.شرایط واکنش PCR بسته به آنالایزر فلورسانس، الگو، پرایمر و غیره متفاوت است. در عملیات خاص، شرایط واکنش بهینه باید با توجه به شرایط خاص سیکلر حرارتی کمی فلورسانس، نوع قالب، اندازه قطعه مورد نظر، توالی پایه قطعه تقویت شده و محتوای GC و طول پرایمرها، از جمله یک زمان واکنش، دمای پرایمر، و غیره طراحی شود.

اصول طراحی پرایمر Real Time PCR

پرایمر جلو و پرایمر معکوس

برای Real Time PCR، طراحی پرایمر بسیار مهم است.پرایمرها به ویژگی و کارایی تقویت PCR مربوط می شوند و می توانند با توجه به اصول زیر طراحی شوند:

◆ طول پرایمر: 18-30 جفت باز.

◆ محتوای GC: 40-60٪.

◆ مقدار Tm: نرم افزار طراحی پرایمر، مانند Primer 5، می تواند مقدار Tm پرایمر را بدهد.مقادیر Tm پرایمرهای بالادست و پایین دست باید تا حد امکان نزدیک باشد.از فرمول محاسبه Tm نیز می توان استفاده کرد: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).هنگام انجام PCR، دمای کمتر از مقدار Tm پرایمر 5 درجه سانتیگراد به طور کلی به عنوان دمای بازپخت انتخاب می شود (افزایش متناظر در دمای آنیل می تواند ویژگی واکنش PCR را افزایش دهد).

◆ پرایمرها و محصولات PCR:

◆ طول محصول تقویت PCR پرایمر طراحی ترجیحاً 100-150 جفت باز است.

◆ پرایمرهای طراحی در ناحیه ساختاری ثانویه الگو باید تا حد امکان اجتناب شود.

◆ از تشکیل 2 یا بیشتر پایه مکمل بین انتهای 3 پرایمرهای بالادست و پایین دست خودداری کنید.

◆ پایه پایانه پرایمر 3 نمی تواند با 3 G یا C متوالی اضافی وجود داشته باشد.

◆ خود پرایمرها نمی توانند ساختارهای مکمل داشته باشند، در غیر این صورت یک ساختار سنجاق سر تشکیل می شود که بر تقویت PCR تأثیر می گذارد.

◆ ATCG باید تا حد امکان به طور یکنواخت در توالی پرایمر توزیع شود و از پایه ترمینال 3 به عنوان T اجتناب شود.

ضمیمه1：Cell مستقیمRT-qPCR کیت کامپوننتبسته مکمل t

1. محلول لیز سلولی